Считается, что область представляет интерес к 3D-культурам плюрипотентных стволовых клеток человека из-за улучшенной плюрипотентности и дифференцировочного потенциала, сформированного этой культурой. Мы описали нашу стратегию инкапсуляции, которая приводит к воспроизводимому образованию сфероидов плюрипотентных стволовых клеток человека. После инкапсуляции эти сфероиды стволовых клеток поддаются культивированию, либо в многолуночных пластинах, либо в перемешиваемых биореакторах.
Наша стратегия инкапсуляции заключается в оптимизации живучести мора и высокой эффективности образования сфероидов. Инкапсулированные сфероиды защищены от сдвига или механической энергии, связанной с перемешиванием или раскачиванием. Развитие стволовых клеток, полученных при клеточной терапии, частично зависит от способности генерировать желаемый клеточный продукт масштабируемым, эффективным и экономичным способом.
Описанная здесь технология инкапсуляции представляет собой шаг в этом направлении. Технология инкапсуляции, описанная здесь, вероятно, будет применима к 3D-культивированию различных типов клеток от других клеток к другим плюрипотентным стволовым клеткам. Начните с приготовления 30 миллилитров двухкратного основного раствора, смешивая 4,8 грамма 35 килодалтон ПЭГ, 10,2 миллилитра среды градиента плотности и 19,8 миллилитра среды DMEM/F-12.
Затем отфильтруйте этот основной раствор с помощью шприцевого фильтра длиной 0,22 микрометра. Далее готовят 50 миллилитров минерального масла с 3-процентным поверхностно-активным веществом, смешивая 48,5 миллилитра минерального масла и 1,5 миллилитра поверхностно-активного вещества. Затем стерилизуют раствор, пропуская его через шприцевой фильтр длиной 0,22 микрометра.
Затем подготовьте 1 молярный DTT, 1 моляр TEA и 1-процентный раствор PF127, как описано в текстовой рукописи. Затем готовят поперечно-линкерную эмульсию, смешивая 4,5 миллилитра минерального масла с 3-процентным поверхностно-активным веществом и 300 микролитрами 1 молярного ДТТ. После вихревания раствора в течение двух минут обжарьте ультразвуком в течение 45-60 минут в ультразвуковой ванне при температуре 20 градусов Цельсия и загрузите его в шприц длиной 5 миллилитров и иглой 27 калибра.
Затем приготовьте защитный масляный раствор, загрузив минеральное масло с 0,5-процентным поверхностно-активным веществом в шприц длиной 5 миллилитров с иглой 27 калибра. Для приготовления раствора оболочки добавляют 32 миллиграмма ПЭГ4 малеимида в 400 микролитра дПБС. Затем добавьте 6 микролитров 1 молярного ЧАЯ.
Вращайте раствор в течение 2 минут и центрифугируйте его через спиновый фильтр. Держите раствор в темноте на коромысле в течение 30 минут перед загрузкой в шприц длиной 1 миллилитр с иглой 27 калибра. Наконец, подготовьте окончательное решение ядра путем повторной приостановки 20 миллионов гПСК в среде 200 микролитров и смешайте с 30 микролитрами 1 процента PF127 и 200 микролитрами 2-кратного раствора.
Вставьте небольшой стержень мешалки в шприц объемом 1 миллилитр. Затем загрузите ячейку, содержащую основной раствор, в шприц с помощью иглы 27 калибра. Начните с размещения связанного капельного устройства PDMS, 4 куска длиной 20 сантиметров и 1 куска впускных микротрубок длиной 5 сантиметров, 1 куска 10-сантиметровой выходной трубки и 6 штук 0,5-сантиметровых соединительных трубок под бактерицидным источником света в течение 30 минут для стерилизации.
Теперь поместите 4 куска входных микротрубок длиной 20 сантиметров в оболочку, масло, эмульсию поперечного линкера и входные отверстия диссоциационного устройства с помощью щипцов. Затем вставьте противоположный конец трубок в шприцевую иглу с соответствующим раствором. Между тем, соедините входное отверстие микрофлюидных устройств и выходное отверстие устройств диссоциации с 5-сантиметровой микропробиркой.
Вставьте 1 выходную трубку в выходное отверстие для жидкости и поместите противоположный конец в коллекторный резервуар. Затем поместите устройство на ступень микроскопа и прикрепите трубку, чтобы избежать каких-либо движений. Выровняйте и сфокусируйте микроскоп на сопле прибора для контроля потока.
Поместите каждый шприц на разные шприцевые насосы и закрепите их должным образом. Запрограммируйте каждый насос в соответствии с протоколами производителя в соответствии со скоростями потока, упомянутыми в тексте рукописи, и запустите поток во всех насосах. Подождите, пока каждая жидкость войдет в устройство, и заполните каналы, выталкивая оставшийся воздух.
Когда образование капсулы стабилизируется, поместите противоположный конец коллекторной трубки в новую коническую трубку, содержащую 5 миллилитров среды mTeSR. Как только будет собрано достаточное количество капсул, высиживайте их в течение 10 минут. Капсулы, находящиеся в масляной фазе, будут находиться в верхней части трубки, которая опускается на дно при осторожном постукивании по трубке.
Чтобы извлечь капсулы, начните с удаления масла из коллекционной трубки. Затем поместите капсулы на ситечко размером с поры 100 микрометров и промойте ситечко обильным количеством среды. Инвертируйте фильтр поверх колодца 6-луночной культуральной пластины и соберите микрокапсулы, пропуская через фильтр 2 миллилитра среды.
Инкубируйте капсулы стволовых клеток в 6-луночной чашке для культивирования при температуре 37 градусов Цельсия с 5 процентами углекислого газа. Меняйте среду через день, собирая капсулы на фильтре клеточного сетчатого фильтра, промывая их избыточной средой и повторно подвешивая их в новую скважину в 6-луночных пластинах с 2 миллилитрами среды. Проводят анализ жизнеспособности путем добавления 4 микролитров 2 микромолярного гомодимера этидия-1 и 1 микролитра 4 микромоляльных растворов Calcein-AM к 2 миллилитрам стерильных DPBS.
Вихрь для обеспечения полного перемешивания. Соберите приблизительно 100 микрокапсул на клеточном ситечке и промойте их стерильным DPBS, чтобы обеспечить диффузию среды из капсул. Соберите их снова в 12-луночную культуральную пластину, используя 1 миллилитр приготовленного раствора, содержащего гомодимер этидия-1 и кальцеин AM, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 20 минут.
Визуализируйте клетки под флуоресцентным микроскопом. Оптимальные и субоптимальные микрокапсулы, изготовленные с использованием генерации микрофлюидных капель, показали различия в морфологии капсул в зависимости от содержания ПЭГ4-малеймида в оболочке. Гладкие капсулы с яркими краями связаны с желаемой механической целостностью.
Скопление бусин в центре капсул указывает на то, что ядро было водным и бусины могли свободно передвигаться. Флуоресцентное кольцо указывало на наличие гидрогелевой оболочки и использовалось для определения толщины оболочки. Живые или мертвые окрашивания через 6 часов после инкапсуляции клеток H9 показали, что клетки достигли более 95 процентов жизнеспособности регулярно во время инкапсуляции.
При сравнении скорости роста и дифференциационного потенциала инкапсулированных и неинкапсулированных сфероидов. Установлено, что процесс инкапсуляции не оказывает неблагоприятного воздействия на гПСК. Пожалуйста, помните, что важно установить оптимальное соотношение расхода между оболочкой ядра и нефтяными потоками.
Невыполнение этого требования может привести к тому, что капсулы не будут механически прочными и могут разорваться во время обработки. Мы хотели бы отметить, что этот метод инкапсуляции был для типов клеток, отличных от человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Мы инкапсулировали, в первую очередь гипотетические, линии раковых клеток и мезенхимальные стволовые клетки, используя аналогичную стратегию.
В настоящее время наша команда разрабатывает следующее поколение микрозахваток. Эти микрозахватки являются биологически активными и могут быть загружены перекрестными факторами для инкапсулированной дифференцировки стволовых клеток.
