Этот относительно простой метод может помочь исследованиям, сосредоточенным на двигательных нейронах и нервно-мышечных соединениях в здоровье и болезни. Этот протокол использует стандартную технологию стволовых клеток и коммерчески доступные микрофлюидные устройства, которые повышают воспроизводимость. Отключение двигательных нейронов и мышечных клеток является ранним явлением при нескольких нервно-мышечных заболеваниях.
Простая гуманизированная модель могла бы помочь разработать стратегии противодействия этому явлению. Мы используем эту модель для исследования расстройства двигательных нейронов, бокового амиотрофического склероза, однако эта модель также может быть использована для других расстройств, при которых двигательная единица имеет важное значение. Начните с переноса устройства с помощью щипцов из транспортного контейнера в чашку Петри, содержащую 10 миллилитров от 70% до 100% этанола для стерилизации в течение 10 секунд.
Переложите устройство щипцами на лист бумаги, чтобы высохнуть на воздухе в Ламинарном потоке в течение примерно 30 минут. После того, как устройство высушено, используйте щипцы, чтобы переместить каждое устройство в отдельную 10-сантиметровую чашку Петри. Чтобы покрыть устройство поли-L-орнитином или ПЛО, добавьте 100 микролитров раствора ООП в верхнюю скважину и наблюдайте за жидкостью, проходящей из верхней скважины через канал в нижнюю скважину.
Затем добавьте 100 микролитров раствора PLO в нижний колодец и повторите с другой стороны микро канавок. Закончите, добавив 100 микролитров раствора PLO с одной стороны, чтобы создать градиент объема между двумя зеркальными сторонами устройства для покрытия микро-канавок. Инкубировать в течение трех часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Через три часа трижды мойте прибор в течение пяти минут с помощью DPBS. Покройте устройство 20 микрограммами на миллилитр ламинина и нейробазальной среды, следуя процедуре, аналогичной покрытию PLO. Инкубируйте устройство в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
На следующий день используйте пипетку на 200 микролитров и расположите наконечник в скважине напротив отверстия канала, чтобы удалить ламининовое покрытие из скважин. После добавления DPBS во все колодцы оставьте устройства с DPBS в Laminar Flow при комнатной температуре для посева клеток. Вырежьте листы SCM до размера устройства, оставив по несколько миллиметров с каждой стороны.
После стерилизации устройств и листов SCM в чашке Петри, содержащей 10 миллилитров от 70% до 100% этанола в течение 10 секунд, перенесите устройства с щипцами на шестилуночную пластину, а листы SCM на 10-сантиметровую чашку Петри для сушки на воздухе в Ламинарном потоке. Расположите устройство на краю, чтобы все стороны высохли в течение примерно 30 минут. Нанесите покрытие на устройства, добавив один миллилитр раствора PLO на каждую скважину к каждому устройству в шестилуночной пластине.
Убедитесь, что устройство плавает поверх раствора PLO с каналом и стороной микро-канавки, обращенной вниз к жидкости. Покройте листы SCM, добавив 10 миллилитров раствора PLO в 10-сантиметровую чашку Петри, и используйте щипцы, чтобы протолкнуть листы SCM в жидкость. Инкубируйте устройства и листы SCM в течение трех часов, как было продемонстрировано ранее.
Через три часа дважды вымойте устройства и простыни SCM в течение пяти минут с DPBS, а затем еще раз помойте в течение пяти минут стерильной водой. Затем переложите каждый лист SCM на индивидуальную 10-сантиметровую чашку Петри на сушку на воздухе. Во время работы под микроскопом в Laminar Flow используйте щипцы для крепления силиконового устройства с каналом и микро-канавкой стороной вниз под углом 90 градусов на лист SCM, гарантируя, что все стороны выровнены.
Слегка прижмите к устройству, чтобы убедиться, что вы герметизируете не только внешние края, но и колодцы, каналы и микро-канавки. Чтобы покрыть устройство ламинином, внутри Laminar Flow и под микроскопом добавьте 100 микролитров по 20 микрограммов на миллилитр раствора ламинина в верхнюю лунку с помощью пипетки 200 микролитров. Наблюдайте за жидкостью, проходящей из верхней скважины через канал в нижнюю скважину без каких-либо утечек вокруг скважины и канала.
Затем добавляют 100 микролитров раствора ламинина в нижнюю лунку, повторяют на другой стороне микроборозы и заканчивают дополнительными 100 микролитрами ламинина с одной стороны, чтобы создать градиент объема между двумя зеркальными сторонами устройства для покрытия микробороздок, затем инкубируют устройство в течение ночи. На следующий день снимите покрытие со скважин пипеткой объемом 200 микролитров, расположив наконечник в скважине напротив отверстия канала, после добавления DPBS ко всем скважинам, оставьте устройства с DPBS в Ламинарном потоке при комнатной температуре для посева клеток. Чтобы покрыть нейронные клетки-предшественники или NPC в микрофлюидном устройстве, удалите DPBS из двух лунок на одной стороне микроборозок в устройстве с помощью пипетки 200 микролитров.
Чтобы засеять в общей сложности 250 000 NPC и от 60 до 100 микролитров среды двигательных нейронов дня на устройство, в правом верхнем углу засейте половину клеточной суспензии близко к отверстию канала под углом 45 градусов. Сделайте паузу на несколько секунд, чтобы клеточная суспензия текла через канал, прежде чем добавлять оставшуюся половину клеточной суспензии в нижний колодец. Используйте ручку, чтобы пометить засеянную сторону как NPC или эквивалент, для легкой ориентации устройства без микроскопа, и инкубируйте в течение пяти минут для прикрепления клеток.
Затем медленно доливайте две засеянные скважины NPC дополнительным 10-дневным моторным нейроном среды общим объемом 200 микролитров на лунку. Используя пипетку объемом 200 микролитров, удалите DPBS из двух лунок на другой стороне микроборозов напротив свежепосеянных NPC. Добавьте 200 микролитров среды двигательных нейронов 10 дня на скважину в несеянные лунки.
Затем добавьте шесть миллилитров DPBS на 10-сантиметровую чашку вокруг устройства, чтобы предотвратить испарение среды во время инкубации. Чтобы изменить среду, медленно удалите среду в обеих скважинах с помощью NPC, расположив наконечник пипетки объемом 200 микролитров на нижнем краю стенки скважины напротив отверстия канала. Чтобы предотвратить повреждение клеток на канале сильным потоком среды, медленно добавляйте от 50 до 100 микролитров свежей среды двигательных нейронов в каждую лунку, непрерывно перемещаясь между верхней и нижней лункой.
Повторяйте процесс до тех пор, пока каждая скважина не будет содержать 200 микролитров среды. На 17-й день дифференцировки двигательных нейронов удалите моторную нейронную среду на несеянной стороне микробороздок в устройстве пипеткой 200 микролитров и промывайте колодцы DPBS. Посейте в общей сложности 200 000 первичных мезоангиобластов человека или MABs в 60-100 микролитрах питательной среды на устройство, посеяв половину клеточной суспензии в верхней лунке.
Сделайте паузу на несколько секунд, чтобы позволить клеточной суспензии течь через канал, прежде чем засевать оставшуюся половину клеточной суспензии в нижний колодец, как показано ранее для покрытия NPC. Инкубируйте устройство в течение пяти минут для прикрепления клеток. Затем дополните две свежезасеянные скважины MAB дополнительной питательной средой и снова инкубируйте, как показано на рисунке.
Чтобы инициировать химиотактическую тактику и объемный градиент на 21-й день дифференцировки двигательного нейрона, добавьте 200 микролитров на лунку нейробазальной среды двигательного нейрона, содержащей факторы роста, в отсек миотрубы, затем добавьте 100 микролитров на лунку базальной среды двигательного нейрона без факторов роста в отсек моторных нейронов. Важно оценить потенциал дифференцировки клеточных линий перед их совместной культивированием в микрофлюидных устройствах. Был определен индекс слияния МАБ, и около 8% были оценены как достаточные для совместной культуры.
Сгенерированные культуры двигательных нейронов были от 85 до 95% положительными для маркеров двигательных нейронов. Для характеристики и количественной оценки количества нервно-мышечных соединений или NMJ количество колокализаций между двигательным нейроном и пресинаптическими маркерами нейрофиламентной тяжелой цепи и маркером синаптофизина и постсинаптического ацетиленового рецептора альфа-бунгаротоксина подсчитывали через каждый стек заболевания и нормализовали при ряде миозин-тяжелой цепи, меченных миотубами, присутствующих в Z-стеке. NMJ появились как единственная точка контакта NMJ, где нейрит касался кластера тонкого холинового рецептора в одной точке взаимодействия.
Или в виде нескольких точек контакта NMJ, где нейрит раздувается и взаимодействует с тонким кластером рецепторов холина на большей поверхности. Количественная оценка процента инновационных моторных нейронов Myotubes показала, что не все Myotube содержат NMJ. При активации двигательных нейронов хлоридом калия наблюдался приток кальция в меченых Fluo-4 миотубах, что подтвердило функциональную связь через нейрит двигательных нейронов в миотрубе, добавление блокатора NMJ d-тубокурарина или DTC к отсеку Myotube привело к ингибированию притока кальция.
Чтобы иметь наибольший успех с этой моделью, невероятно важно выполнить проверку качества клеточной линии и избежать образования пузырьков воздуха в каналах устройства. Сочетание нервно-мышечного соединения в чашке с другими типами прямых клеток МПК еще лучше имитирует ситуацию in vitro, что также позволяет изучить роль этих типов клеток.
