Этот протокол описывает, как спроектировать функциональные 3D in vitro нервно-мышечные соединения человека, которые могут быть использованы для исследования нервно-мышечных патологий и тестирования потенциальных терапевтических средств. Эта методика использует одновременную оптогенетическую стимуляцию и обработку видео. Это количественные изменения в функции нервно-мышечных соединений во время развития и из-за внешних факторов, таких как нейротоксины и сыворотка от пациентов с миастенией.
Этапы, связанные с посевом мышечной клетки и двигательных нейронов в биореактор, могут быть сложными на первых порах. Хранение коллагеновой гелевой смеси на льду может помочь продлить время, доступное для посева всех клеток, прежде чем гель затвердеет. Начните с смешивания основания 10 к 1 со смесью отверждающего агента полидиметилсилоксана или PDMS и поместите смесь в вакуумную камеру.
Закройте все клапаны и включите вакуум, чтобы дегазировать смесь в течение не менее 30 минут, пока не останутся пузырьки воздуха. Вылейте смесь в формы и дегазируйте формы в вакуумной камере в течение 1 часа, затем закройте формы верхней половиной формы в правильной ориентации. Поместите шестиугольный стальной стержень над центром и зажмите с обеих сторон.
Затем наполните верхнюю часть PDMS и отверждайте формы в печи с температурой 65 градусов Цельсия в течение не менее 4 часов. После того, как формы остынут до комнатной температуры, снимите платформы с форм. Между тем, стеклянная крышка скользит в 1% неионного поверхностно-активного полиола в течение 30 минут, следя за тем, чтобы крышка не укладывалась и была должным образом покрыта, затем хорошо промойте их дистиллированной водой и высушите их на ночь при 65 градусах Цельсия.
Обработайте стеклянные крышки и платформу PDMS с помощью плазменного очистителя на высоком уровне с 6 литрами в минуту кислорода в течение 1 - 2 минут. После обработки соедините их вместе, прижав PDMS к крышке в течение не менее 30 секунд. Приготовьте смесь 4 к 1 по 3 миллиграмма на миллилитр коллагена 1 и солюбилизированную основную мембранную матрицу, затем повторно суспендируйте миобласты в этой свежеприготовленной коллагеновой смеси.
Затем добавьте 15 микролитров этой клеточно-коллагеновой суспензии в каждую мышечную камеру биореактора, обязательно распределив суспензию по обеим стойкам с помощью наконечника пипетки. Дайте клеточной гелевой смеси полимеризоваться при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, затем заполните каждый биореактор хорошо 450 микролитрами миотонической питательной среды. На 11-й день дифференцировки мотонейрона переложите клетки и среды в 50-миллилитровую трубку и дайте невросферам осесть на дно в течение 5 минут.
Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки в 15 миллилитрах культуральной среды суспензии мотонейрона, дополненной 20 нанограммами на миллилитр нейротрофического фактора мозга и 10 нанограммами на миллилитр глиального клеточного нейротрофического фактора. На 14-й день протоколов дифференциации посейте мотонейроны в платформу. Приготовьте гелевую смесь 4 к 1 из 2 миллиграммов на миллилитр коллагена 1 и солюбилизированную основную мембранную матрицу.
Используйте 400-нанометровый клеточный сетчатый фильтр для выбора больших невросфер и повторного суспендирования их в приготовленной гелевой смеси. Осторожно хорошо аспирировать среды из резервуара и нейросферы, затем добавить 15 микролитров гелевой смеси в канал невросферы. Загрузите 10-микролитровую пипетку с 10 микролитрами геля и выберите одну невросферу.
Отложите невросферу в канал нейросферы, гарантируя, что она находится в камере, затем медленно поднимите пипетку, высвобождая оставшийся гель после осаждения нейросферы. Дайте гелю полимеризоваться в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия, затем добавьте 450 микролитров NbActiv4, дополненных 20 нанограммами на миллилитр нейротрофического фактора мозга и 10 нанограммами на миллилитр нейротрофического фактора глиальных клеток в резервуары. Для визуализации используйте перевернутый флуоресцентный микроскоп с научным программным обеспечением для полупроводниковой камеры с комплементарным металлом и оксидом.
Установите значение Binning на 2 x 2, Экспозиция до 20 миллисекунд, Скользящий затвор включен, Скорость считывания до 540 мегагерц, динамический диапазон до 12 бит и Усиление 1 и Режим датчика на перекрытие. Используйте 2-кратный объектив на микроскопе, чтобы изобразить микроткани и прикрепить камеру живых клеток к стадии микроскопа. Выберите интересующую область, содержащую иннервируемые скелетные ткани, чтобы свести к минимуму размер файла и время обработки, затем поместите 594-нанометровый долгопроходный эмиссионный фильтр между образцом и объективом изображения, чтобы отфильтровать импульсы синего света от камеры.
Затем поместите прямоугольную 4-луночную пластину, содержащую четыре биореактора, в камеру живых клеток, затем щелкните интерактивный вид и центр и сфокусируйте изображение с желаемой рентабельностью инвестиций. Загрузите пользовательский код макроса из папки GitHub, чтобы управлять положением сцены, платой Arduino и получением видео, а затем установите выходной ролик как день подчеркивание группы тканей подчеркивание название ткани подчеркивание точка эксперимента ND2. Запустите макрокод с заданными на сцене координатами X и Y и получите быстрый таймлапс с 1700 кадрами со скоростью 50 кадров в секунду.
После получения изображения замените носитель и верните образцы в инкубатор. Подождите не менее 24 часов между сеансами получения изображения, чтобы избежать усталости тканей. Для обработки фильмов загрузите файлы из папки GitHub и используйте пользовательский код MATLAB для обработки видео в пакетном анализе.
Откройте скрипт рекурсивного анализа ОС, чтобы все полученные видео находились в одной папке. Настройте параметры предварительного анализа и запустите скрипт рекурсивного АНАЛИЗА OSAnalysis для анализа фильмов с помощью параллельной обработки. При необходимости настройте параметры постанализа, такие как базовое время, порог пика, мин-мин протуберанец и мин-мин ширина.
Наконец, сгенерируйте видео- и графовые выходные данные, запустив рекурсивныйOSMovie, чтобы сгенерировать видеофайл для каждой ткани с соответствующей трассировкой сократимости. Этот протокол был протестирован с использованием двух систем с различными масштабами, микрофлюидного устройства, дающего скелетные мышечные ткани длиной 1 миллиметр, включающие примерно 20 000 миобластов, и систему биореактора с открытым отверстием, в результате чего мышечные ткани длиной 4 миллиметра, содержащие примерно 450 миобластов. Оптическая установка была построена для обеспечения контролируемой стимуляции мотонейронов синим светом, а функция NMJ была повышена с помощью пользовательского макроскрипта микроскопа в паре с пользовательским кодом Arduino.
Этот код включает настраиваемые настраиваемые параметры и определяет, инициируется ли сокращение на основе времени между световым импульсом и началом пика сократимости. Система зафиксировала улучшение функции NMJ в тканях, показав увеличение триггерных реакций через неделю после изготовления тканей, а затем стабильную функцию в течение дополнительной недели. Альфа-бунгаротоксин остановил все спроизвоцированные и спонтанные сокращения, что привело к полному нарушению функции NMJ, демонстрируя, что световая стимуляция тканей требует функционального NMJ.
Анализ тканей, обработанных сывороткой 20% миастении в течение 48 часов, показал снижение функции по сравнению с контрольными тканями, обработанными сывороткой от здоровых доноров. Через 48 часов после удаления и промывания сыворотки инженерные NMJ показали восстановление функции. Убедитесь, что все биореакторы находятся в печи в течение одинакового времени, чтобы избежать изменения жесткости между партиями.
Кроме того, обязательно проверьте посев двигательных нейронов с помощью микроскопа. После этой процедуры можно выполнить метабаломику, протеомику и скрининг CRISPR для сбора дополнительной информации и лучшего понимания механистических изменений, вызванных больной сывороткой.
