Использование микроинъекции для доставки конструкций ДНК в стронгилоиды позволяет нам генерировать нокауты и трансгены, которые могут быть использованы для изучения того, как эти черви развиваются, ориентируются в окружающей среде и паразитируют на хозяевах. Пока это единственная успешная методика генерации нокаутов и трансгенов у этих паразитов. За день до микроинъекции добавьте 180 микролитров раствора агарозы на крышку с помощью стеклянной пипетки Пастера, затем немедленно опустите сверху второй слип крышки, чтобы сплющить агарозу в тонкую прокладку.
Через 5-10 секунд снимите верхнюю крышку, сдвинув их друг от друга, и определите, на каком слайде находится агаровая подушка, и положите ее лицевой стороной вверх. Затем выберите крошечный кусок стеклянного осколка из сломанного скольжения крышки и, используя щипцы, осторожно вдавите его в агар возле верхнего края прокладки. В день микроинъекции выровняйте держатель Baermann, который представляет собой сито, изготовленное из двух пластиковых колец с двумя слоями нейлоновой тюлевой сетки, закрепленной между ними тремя перекрывающимися кусками лабораторной ткани.
Затем добавьте фекально-древесную смесь в держатель Baermann. Затем поместите держатель Baermann с фекально-угольной смесью в воронку, сложите кусочки тканей вокруг фекально-угольной смеси и добавьте достаточно воды, чтобы погрузить большую часть фекального древесного угля. Затем закройте воронку 15-сантиметровой пластиковой крышкой чашки Петри, чтобы она содержала запах, и пометьте воронку по мере необходимости.
Через один-два часа подержите 50-миллилитровую центрифужную трубку под резиновой трубкой в нижней части воронки и осторожно откройте зажимы внизу, чтобы дозировать от 30 до 40 миллилитров воды, содержащей червей, в 50-миллилитровую трубку. Тогда. перенести 15 миллилитров воды Baermann, содержащей червей, в 15-миллилитровую центрифужную трубку. Раскрутите трубку, удалите до 13 миллилитров супернатанта и выбросьте его в контейнер для жидких отходов с йодом, чтобы убить любых червей.
Собрав всех глистов, осмотрите гранулы глистов на дне трубки. Если червей не видно, подождите один-два часа, а затем соберите больше червей из аппарата Baermann. Перенесите червей в как можно меньшем количестве воды на шестисантиметровую 2%-ную пластину среды роста нематоды с газоном E.coli HB101 и используйте эту пластину в качестве исходной пластины для микроинъекции.
Под рассекающим микроскопом накройте осколок стекла на крышке микроинъекционной прокладки галогенуглеродным маслом с помощью стандартной платиновой червячной кирки. Затем поместите крышку микроинъекционной прокладки на микроинъекционный прицел и найдите осколок стекла, покрытый маслом. Выровняйте осколок стекла таким образом, чтобы край был перпендикулярен направлению иглы, чтобы служить поверхностью, используемой для разрыва иглы.
Затем, используя рассекающий микроскоп, убедитесь, что игла не имеет пузырьков или мусора в коническом валу, затем закрепите иглу на 1-1,5 сантиметра в герметичный держатель. Расположите кончик иглы в центре поля зрения микроскопа глазом и под малым увеличением расположите кончик иглы в поле зрения перпендикулярно стороне осколка стекла. Затем переключитесь на более высокое увеличение и выровняйте кончик иглы с краем стекла, приближаясь, но не касаясь его.
Затем, чтобы разбить кончик иглы и дать жидкости течь, осторожно постучите иглой по стороне куска стекла, применяя непрерывное давление от газа. Как только жидкость начнет течь, проверьте форму наконечника и убедитесь, что он острый с легко протекающей жидкостью. Когда жидкость хорошо вытечет из иглы, переместите микроинъекционный слайд в рассекающий прицел и добавьте один-два микролитра галоуглеродного масла на агаровую прокладку для размещения червей.
Перенесите от 20 до 30 молодых взрослых стронгилоидов на пластину среды роста 2% нематод без бактерий в течение не менее пяти минут, чтобы удалить лишние поверхностные бактерии и выбрать отдельных червей для микроинъекции. Добавляйте больше червей в тарелку по мере необходимости во время инъекции. Используя небольшое количество галогенуглеродного масла на червячной кирке, выберите молодую взрослую самку Strongyloides с одним-четырьмя яйцами в гонаде из пластины без бактерий и перенесите червя в крошечную каплю масла на агаровой подушке.
Используя червячную кирку, аккуратно расположите червя, чтобы он не сворачивался, а гонада была видна и легко доступна. Затем поместите червя в поле зрения микроинъекционного микроскопа, убедившись, что гонад находится на той же стороне, что и игла, и расположен так, что игла будет контактировать с гонадой под небольшим углом. Далее поднесите кончик иглы в сторону от червя в той же фокальной плоскости.
Затем, нацеливаясь на руку гонады около середины червя, аккуратно вставьте иглу в гонаду с помощью микроинъектора. Немедленно надавите на иглу, чтобы аккуратно заполнить всю руку гонады раствором ДНК. После того, как было введено достаточное количество жидкости, извлеките иглу и обратите внимание, что рана закрывается.
Повторите процедуру с другой рукой гонады, если она видна. Как только инъекция будет завершена, быстро убедитесь, что игла не забита, приложив давление кончиком иглы на агаровую прокладку, затем перенесите слайд с введенным червем в рассекающий микроскоп. Чтобы восстановить введенного червя, сначала поместите несколько капель червячно-буферного физиологического раствора на червя, чтобы сбросить его с агаровой подушки.
Затем соберите небольшое количество бактерий на червячной кирке и коснитесь червя с адгезивными бактериями, чтобы удалить его из жидкости. Аккуратно перенесите червя на восстановительную пластину. Для поведенческих экспериментов перенесите от 20 до 30 личинок на пластину среды роста 2% нематоды с толстым газоном бактерий HB101 и под флуоресцентным рассекающим микроскопом идентифицируйте личинок, выражающих интересующий трансген.
Затем, используя червячную кирку, выберите трансгенные личинки и поместите их в небольшое часовое стекло с червячно-буферным физиологическим раствором. Для микроскопии, используя лезвие бритвы, нанесите сетку на пластиковое дно 10-сантиметровой хемотаксисной пластины, чтобы легко отслеживать местоположение червей на пластине. Затем добавьте три микролитра личинок в червячно-буферном физиологическом растворе в квадрат на сетке, заполняя столько квадратов, сколько необходимо.
Затем добавьте 15-20-микролитровые капли 1% никотина в воду к каплям червя. Через четыре минуты, когда черви парализованы, экранируйте их с помощью флуоресцентного рассекающего микроскопа. Здесь показаны трансгенные личинки Strongyloides stercolaris с неполным и полным паттерном экспрессии act-2 mRFPmars.
Пятнистая экспрессия в мышце стенки тела более распространена, когда трансген не интегрирован в геном. Напротив, последовательная экспрессия по всей мышце стенки тела часто указывает на то, что трансген интегрировался в геном. Ключевым шагом является позиционирование иглы в той же плоскости фокусировки, что и гонада, чтобы гарантировать, что ДНК вводится в гонаду и будет включена в развивающиеся яйцеклетки.
Развитие этой методики позволило изучить функцию генов у паразитических нематод, что дает новое представление о механизмах паразитизма и взаимодействия хозяина и паразита.
