Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области восстановления и регенерации тканей об ассоциациях между цитопротекторными путями, окислительным стрессом и ответом на заживление ран. Основным преимуществом этой мощной техники является то, что вы можете измерить реактивных видов кислорода в ране, в режиме реального времени, чтобы определить их влияние на регенерацию тканей. Демонстрацией процедуры со мной будет Дженнифер Квонг, научный сотрудник в моей лаборатории.
Используйте глюкометр для измерения глюкозы в крови каждого обезболивающего от восьми до 12 недель диабетической мыши. И использовать триммер волос и крем для депилятельной для удаления спинных волос от первого животного. Используйте спирт салфетки два раза, чтобы очистить открытые кожи и драпировка животного так, что только хирургическая область подвергается.
Когда алкоголь высохнет, использовать стерильные 10 миллиметров биопсии ударов, чтобы создать два, 10 миллиметров полной толщины раны, простирающиеся через панникулус карнос в соответствии с хорошо установленной excisional раны метод заживления. Используйте силиконовый лист толщиной 0,5 миллиметра с 10-миллиметровыми круглыми вырезами, чтобы разбрысьте раны открытыми и закрените пребывание с прерванными 4/0 шелковыми швами. Затем поместите мышей на тепловую площадку с мониторингом до полного восстановления, прежде чем вернуться в свою индивидуальную клетку, обеспечивая бумажные полотенца в качестве дополнительного материала гнездования в течение двух недель.
На следующий день, применять либо контроль нонсенс небольшой вмешательства РНК гель или экспериментальных малых вмешательства Keap1 гель в верхней части раны каждого животного и обернуть каждый туловище с прозрачной пленкой соусом держать гель на месте, оставляя конечностей бесплатно. На третий день эксперимента загрузите один миллиметр шприца, оснащенного иглой 27-го калибра со свежеприготовленным раствором L-012, и оберните шприц, чтобы защитить раствор от света. Чтобы изумить раны, аккуратно снимите прозрачную пленку с каждой из мышей, не нарушая раны, и поместите мышей в камеру визуализации биолюминесценции системы визуализации.
Установите приток системы визуализации и уровень кислорода индукционной камеры до одного литра в минуту и изображение мышей по биолюминесценции и яркому полю на базовом уровне. Далее, протрите животы с спиртом салфетки затем ввести пять миллиграммов L-012 раствор на 200 граммов массы тела, IP, в каждой мыши, как только алкоголь высох. Инъекция L-012 решение, не нарушая раны на спинной коже имеет решающее значение, потому что любое искажение повлияет на траекторию заживления ран и интерпретации данных.
Убедитесь, что животное надежно находится в спинной лежа перед инъекцией. Сразу же после инъекции поместите мышей обратно в их соответствующих местах в камере изображений и изображения животных в течение одной минуты каждые четыре минуты в течение 60 минут изображения периода, определяя 10-миллиметровую рану как область интереса для определения уровня реактивных видов кислорода. Затем поместите мышей на тепловую площадку с мониторингом до полного восстановления, прежде чем вернуть животных в свои отдельные клетки.
Через три дня после создания двусторонних ран в соответствии с установленной эксцисионной модели раны, биолюминесценции не наблюдается до инъекции L-012. После инъекции раствора L-012 биолюминесценция наблюдается в районах раны, где обнаруживаются реактивные виды кислорода. Запись биолюминесценции в течение одной минуты каждые четыре-пять минут в течение 60 минут демонстрирует биолюминесцентное насыщение области интереса с течением времени, при этом оптимальное время визуализации для достижения полного насыщения L-012 наблюдается около 50 минут.
Биолюминесценция в каждой области раны, представляющих интерес до и после инъекции L-012 в нонсенс малых вмешательства РНК лечение или Keap1 малых вмешательства РНК обработанных мышей можно рассчитать путем деления общего количества интенсивности света по области. Анализ день 10 ран ткани разделов, чтобы подтвердить точность реактивных кислорода видов измерения уровня H и E окрашивания показывает снижение клеточного проникновения в небольшие вмешательства Keap1 обработанные раны по сравнению с небольшой вмешательства нонсенс обработанных тканей, что свидетельствует о снижении воспалительных морфологии в экспериментальных гель-обработанных животных. Анализ иммунодеактивности F4/80, маркера макрофага белка на секциях раневых тканей, указывает на снижение количества макрофагов в небольших мешающих Keap1 обработанных ранах по сравнению с небольшими мешающих нонсенс обработанных ран, еще больше подчеркивая обоснованность этого метода.
При попытке этой процедуры, убедитесь, что подтвердить L-012 не истек и перемешать раствор в месте, защищенном от света. После этой процедуры, целевые зонды и методы на основе иммуно-анализа могут быть использованы для изучения субклеточной локализации реактивных видов кислорода и их коррелятов, что позволяет быстро оценить вмешательства и механизмы, которые влияют на статистику redux ран.
