Используя эту процедуру очистки sporozoite и микроинъекции, по существу любой микроб хозяина можно изучить в любой системе органов, полученных из тканей. Используя этот метод, мы можем контролировать количество чистых спорозоитов, вводимых в органоидный люмен или апическую сторону органоида. Чтобы очистить C.parvum sporozoites, перенесите ойцист в 15-миллилитровую трубку и повторно посовестит клетки в один раз от 10 до седьмого oocyst на миллилитр excystation средней концентрации.
Через 60 -90 минут при 37 градусах по Цельсию смешайте 14 миллилитров соответствующего раствора для мытья с ооцостами и от осадки клеток центрифугированием. Аспирировать супернатант тщательно, чтобы избежать потери oocysts и повторно sporozoic гранулы в три раза от 10 до седьмого oocyst на один-два миллилитров концентрации DMEM. Чтобы удалить все оставшиеся ойосты и раковины, поместите 10-миллилитровую бочку шприца, оснащенную 47-миллилитровым аппаратом держателя фильтра, оснащенным поликарбонатным фильтром размером с три микрометра, в 15-миллилитровую трубку при четырех градусах Цельсия.
Добавьте в сборку фильтра 7,5 миллилитров подвески sporozoite. Когда весь объем прошел через ситечко под действием силы тяжести, мыть все оставшиеся клетки через ситечко с еще 7,5 миллилитров DMEM. Когда все мыть прошло через ситечко, собирать фильтрованную подвеску sporozoite путем центрифугации в течение 10 минут и этикетки гранулы в 50 до 100 микролитров соответствующей органоидной культуры среды, дополняется 0,05% быстро зеленый краситель, и L-глутатион, бетаин, L-цистеин, линолевая кислота, и таурин, содержащий снижение буфера.
Чтобы микроинъектировать паразитов в апиатической стороне 3D органоида, сначала используйте micropipette шкив для подготовки капилляров инъекции стекла. Используйте типсы, чтобы сократить кончик капилляра до диаметра от девяти до 12 микрометров, чтобы обеспечить легкий поток sporozoites или oocysts, если вы решите вводить oocysts непосредственно, и использовать микро-погрузчик советы, чтобы заполнить каждый капилляр с быстрой зеленой красителя помечены oocyst или sporozoite подвески. Затем загрузите первый капилляр, заполненный спорозоитом, в микроинъектор и используйте перевернутый микроскоп при увеличении в 5 раз и постоянном давлении на микроинъекцию от 100 до 200 нанолитров суспензии в каждый органоид.
Протокол excystation приводит к выпуску sporozoites от приблизительно 70 до 80% из oocysts. Поэтому необходимо отфильтровать оставшиеся оболочки oocyst с помощью трехмиметровой фильтрации. Удалите почти 100% невысоких oocysts.
Кроме того, добавление зеленого красителя помогает обеспечить инъекцию всех органоидов, и позволяет визуализировать инъекционные органоиды, по крайней мере 24 часов после инъекции. Хотя это хорошо практикуется метод, сканирование электронной микроскопии могут быть использованы для обеспечения того, чтобы процесс эксцистанции не повредить sporozoites или oocysts. Инъекция равного количества ооцистов в органоидный люмен может быть визуально подтверждена простыми микроскопическими изображениями.
Иммунофлуоресценция анализы также могут быть использованы для изучения типов клеток, которые инфицированы Cryptosporidium. После того, как дифференцированные органоиды были инфицированы в течение пяти дней, наличие сорозоитов в oocysts может быть подтверждено путем высыхания части oocysts на клей слайд, фиксация oocysts с метанолом, и сочетание DAPI окрашивания с подходящим oocyst-специфических антител. Для получения максимальных результатов используйте свежие ооцосты, используйте один и тот же капилляр для всех инъекций и меняя средства массовой информации каждый день после инъекции.
Используя этот метод, различные лаборатории в настоящее время начинают использовать органоиды для изучения взаимодействия хост-микробов. Мы изучаем комменсалы, а также другие патогенные микроорганизмы в аналогичных условиях органоидной микрокультуры. Поскольку Cryptosporidium является человеческим паразитом, важно проводить эти эксперименты в соответствии с правилами безопасности уровня 2.
