Этот протокол позволяет экстрагировать молекулы гликогена печени таким образом, чтобы сохранить их структуру и ограничить количество потерянных мелких частиц гликогена. С предыдущими исследованиями, показывающими, что диабет изменяет структуру гликогена, этот метод может быть полезен при изучении диабета и различных болезней накопления гликогена. Чтобы извлечь гликоген из печени, начните с переноса одного грамма замороженной ткани печени в 15-миллилитровую пробирку, содержащую шесть миллилитров буфера для выделения гликогена.
Во время выдержки на льду гомогенизируйте ткани печени с помощью тканевого гомогенизатора. Когда закончите, переложите пол-три миллилитра клеточной суспензии в новую пробирку с последующим кипячением в течение 10 минут. Вторую половину суспензии держите на льду, чтобы извлечь гликогенсодержащие ассоциированные белки, которые не денатурируются.
Для определения содержания гликогена удалите восемь микролитров аликвоты из каждой пробирки и держите пробирку на льду. После отжима оставшейся суспензии при 6 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия переложите надосадочную жидкость в ультрацентрифужные пробирки для центрифугирования их при 3,6 умножении на 10 до пятого G и четырех градусах Цельсия в течение 90 минут. После выброса оставшихся надосадочных растворов повторно суспендируйте гранулы в 1,5 миллилитрах буфера для выделения гликогена.
Затем наслойте образцы на 1,5 миллилитра 30%-ного раствора сахарозы в четырехмиллилитровые ультрацентрифужные пробирки, а затем центрифугируют, как описано выше, в течение двух часов. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах деионизированной воды. Чтобы получить гликоген из клеточной суспензии, добавьте к клеточным суспензиям 800 микролитров абсолютного этанола и хорошо перемешайте.
Затем храните смеси при температуре минус 20 градусов Цельсия не менее одного часа, чтобы выпало осадко. После выпадения осадка центрифугируют образцы при 6 000 G в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия и повторно суспендируют гранулы гликогена в 200 микролитрах деионизированной воды, чтобы трижды повторить процесс осаждения этанола. Из конечной клеточной суспензии удалите аликвоту в восемь микролитров из каждой пробирки для определения содержания гликогена.
Затем заморозьте оставшиеся надосадочные жидкости в жидком азоте и высушите на ночь. На следующий день храните высушенные образцы гликогена в морозильной камере при температуре минус 20 градусов по Цельсию. В исследовании были проанализированы чистота, выход сырой нефти и выход гликогена в высушенном образце гликогена, извлеченном в различных условиях.
Существенных различий в выходе сырой нефти и гликогена между группами, извлеченными в различных условиях, не выявлено. Напротив, на чистоту гликогена значительно влияли концентрация сахарозы и добавление стадии кипения. Гликоген с высочайшей чистотой экстрагировали с использованием 30%-ной концентрации сахарозы и 10-минутной стадии кипячения.
Гликоген извлекали из гомогената печени с помощью 30%50% или 72,5% сахарозы, кипяченой или некипяченой, чтобы оценить влияние различных условий на размер молекул в конечном экстракте. Анализ длины цепи был проведен на шести печени как в вареной, так и в невареной печени с использованием концентраций сахарозы 30%, 50% и 72,5%. Рассчитано содержание молекул гликогена или бета-частиц с гидродинамическим радиусом RH менее 30 нм.
Кипяченые образцы имели более низкие средние значения относительной влажности и более высокое содержание частиц, чем некипяченые образцы. Кроме того, более низкие концентрации сахарозы приводили к более низким значениям относительной влажности и более высокому содержанию бета-частиц. Введение ступени кипячения также привело к снижению относительной влажности max или максимальных значений, в то время как концентрация сахарозы не оказала существенного влияния.
Убедитесь, что ткань полностью гомогенизирована и от нее не осталось кусочков. Таким образом, этот метод прокладывает нам путь к изучению путей, связывающих меньшие бета-частицы вместе, чтобы сформировать более крупные альфа-частицы.
