Этот протокол выделяет ключевые шаги для амплификации, дифференцировки и криоконсервации первичных эпителиальных клеток носа. В условиях нашей культуры первичные эпителиальные клетки носа имитируют эпителий легких. Это позволяет проводить культуры, полученные из пациентов, и персонализированные медицинские исследования из свежих или биобанковских клеток.
Полученные от пациента культуры эпителия носа могут быть использованы для оценки активности CFTR и помощи в терапии муковисцидоза путем оценки индивидуального ответа пациента на новые методы лечения. Продемонстрировать процедуру будет Аурели Хаттон, инженер из моей лаборатории. Для начала вырастите эпителиальные или HNE клетки носа, в 10 миллилитрах амплификационной среды.
Инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в колбе площадью 75 квадратных сантиметров, покрытой коллагеном, пока она не достигнет 80-90% слияния. Меняйте среду каждые 48-72 часа. Позже промыть клетки 10 миллилитрами магния и кальция без DPBS.
Аспирировать и отбросить физиологический раствор. Перед добавлением двух миллилитров 0,25% трипсина и возвратом колбы в инкубатор на восемь -12 минут. Позже плотно постучите по колбе ладонью, чтобы помочь отслоению клеток.
Добавьте 10 миллилитров амплификационной среды, чтобы остановить ферментативную реакцию. Энергично промойте колбу, используя 10-миллилитровую пипетку, чтобы вытянуть и изгнать амплификационную среду над поверхностью колбы, чтобы промыть и отсоединить ячейки и собрать ячейки в 15-миллилитровую трубку. Центрифугируйте клеточную суспензию в 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте супернатант.
Повторно суспендировать гранулу в пяти-10 миллилитрах амплификационной среды. Затем подсчитайте клетки на гемоцитометре. После подсчета клеток центрифугируют клетки в 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и отбрасывают супернатант.
Затем повторно суспендируют гранулу в обогащенной морозильной среде для получения от трех до пяти раз по 10 до шести клеток на миллилитр и помещают в криокзлот. Медленно замораживайте клетки, снижая температуру примерно на один градус Цельсия в минуту в соответствующем криофризационном контейнере при минус 80 градусах Цельсия. На следующий день переместите сохраненный образец в контейнер для хранения азота для длительного хранения.
Разогрейте свежеприготовленную амплификационную среду на водяной бане, установленной до 37 градусов Цельсия. Извлеките криопузырики из резервуара для хранения азота и быстро поместите их на водяную баню, следя за тем, чтобы не погрузить весь флакон в воду. Снимите криопузырики с водяной бани, когда останется только небольшая замороженная капля.
Протрите флаконы 70% спиртом и поместите их под капот. Используя одну миллилитровую пипетку, переместите размороженные ячейки в 15-миллилитровую трубку. Затем добавьте один миллилитр теплой амплификационной среды по каплям.
Через одну минуту добавьте еще один миллилитр амплификационной среды и подождите минуту. Добавьте 10 миллилитров амплификационной среды и центрифугу в 500 раз G в течение двух минут при четырех градусах Цельсия. Аспирировать и выбросить супернатант.
Повторно суспендировать гранулу в объеме амплификационной среды, необходимой для достижения плотности ячейки от одного раза 10 до шести ячеек на миллилитр. После посева клеток на колбу площадью 25 квадратных сантиметров, покрытую коллагеном, содержащую амплификационную среду, инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Визуально наблюдайте за расширением клеток в течение двух-трех дней, прежде чем выполнять амплификацию клеток, как показано ранее.
Засейте клетки с плотностью от 3,3 раза 10 до пятой ячейки на фильтр на 0,33 квадратных сантиметра покрытых коллагеном пористых фильтрах, дополненных 300 микролитрами амплификационной среды на апикальной стороне и 900 микролитрами воздушной жидкой среды на базолатеральной стороне. Через три дня аспирируйте аспиральную среду и культивируйте клетки на границе раздела воздух-жидкость в течение трех-четырех недель в воздушно-жидкой среде, чтобы создать дифференцированный эпителий. Меняйте базальную среду каждые 48-72 часа.
Свежие клетки HNE, культивируемые на границе раздела воздух-жидкость, демонстрировали типичные черты поляризованного и дифференцированного респираторного эпителия. В 78 образцах клеток HNE сравнивали показатели успеха при чистке носа сразу же и после одного-семи дней транспортировки в промывочной среде. Первоначальный средний процент успешных культур составлял 82% и достигал 87% в образцах, посеянных от нуля до пяти дней.
83% образцов, которые успешно дифференцировались в свежих условиях, также были успешными в криоконсервированных образцах. Аналогичным образом, в образцах, которые не смогли дифференцироваться в свежих условиях, 71% также не были успешными в условиях замораживания-оттаивания. Более того, 50% образцов, замороженных от двух до трех раз по 10-шесть клеток на кри флакон, не выросли при размораживании, достигнув 80% для менее чем двух раз 10 до шести клеток.
Для изменения тока короткого замыкания в ответ на форсколин и изменения тока короткого замыкания в ответ на ингибитор CFTR 172 в клетках, обработанных ДМСО, не наблюдалось существенной разницы между свежим или замороженным размороженным HNE. После лечения оба типа клеток демонстрировали значительную коррекцию с увеличением изменения тока короткого замыкания в ответ на форсколин и уменьшением изменения тока короткого замыкания в ответ на ингибитор CFTR 172. корректирующий ответ двойной терапии функцией CFTR оценивали по сравнению с изменениями тока короткого замыкания клеток HNE, обработанных ДМСО, в ответ на форсколин и в ответ на ингибитор CFTR 172 были значительно улучшены как VX-809 плюс VX-770, так и VX-661 плюс VX-770.
Сравнивались три различных модулятора CFTR в HNE у шести гомозиготных пациентов F508del. При использовании в комбинации с корректором и потенциатором CFTR, как вершинными, так и CFTR-модуляторами, корректировали изменение тока короткого замыкания в ответ на форсколин и изменение тока короткого замыкания в ответ на ингибитор CFTR 172 в аналогичной степени. При замораживании клеток HNE важно иметь не менее 3 миллионов клеток на криокзлот, чтобы увеличить шансы на хороший результат при оттаивании.
Было показано, что активность CFTR в клетках HNE является хорошей прогностической моделью для оценки и корректировки персонализированной терапии при муковисцидозе.
