Индивидуализированная терапия для пациентов с муковисцидозом может быть достигнута с помощью модели заболевания in vitro для понимания активности CFTR на исходном уровне. Органоиды эпителия носа человека, или органоиды HNE, производят просветы различных размеров, которые коррелируют с активностью CFTR, различая органоиды CF и без CF. Здесь мы подробно описали методологию культивирования и визуализации этих органоидов HNE.
Дисфункциональный перенос ионов эпителия, особенно хлорида и бикарбоната, приводит к уменьшению объема эпителиальных выстилающих жидкостей. Это также влияет на секрецию слизи, что приводит к слизистой оболочке и обструкции. Поэтому наша модель HNE была разработана для различных применений, в зависимости от экспериментального дизайна и ресурсов исследователя.
Помимо оценки активности CFTR на исходном уровне или в ответ на терапию, этот метод также может быть применен к другим заболеваниям, связанным с функцией эпителиальных клеток, особенно к транспорту эпителиальной клеточной жидкости. Эти методы были разработаны в первую очередь для использования в исследованиях муковисцидоза. Другие исследования, оценивающие эпителий дыхательных путей, такие как первичная цилиарная дискинезия, также могут найти эти методы полезными.
Эти методы требуют внимания к деталям и точности. Они также требуют тщательного наблюдения, чтобы убедиться, что первоначальное расширение клеток является целесообразным. Следите за всеми культурами каждый день, и успех будет более вероятным.
Для начала диссоциируют биопсию носовой щетки на 8 миллитр сред RPMI в конической трубке объемом 15 миллилитров, несколько раз пропуская цитологическую щетку через кончик пипетки с большим отверстием в один миллилитр. Центрифугируйте клетки в 500 раз г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Отбросьте супернатант, а затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в трех миллилитрах раствора для отслоения клеток.
Инкубировать при комнатной температуре в течение 16 минут для переваривания. Используйте пять миллилитров расширительной среды для промывки клеток дважды. Затем добавьте их в колбу T75, предварительно засеянную облученными, инактивированными и 50-60% сливающимися фибробластами 3T3.
Позвольте клеткам совместно культивировать и расширяться в расширительной среде в течение 7-14 дней. Если антибиотики были введены для клеток, полученных от пациентов с муковисцидозом, среда должна быть заменена средой расширения без антибиотиков после первых трех дней культивирования и может продолжать менять среду каждые два дня до 80% слива. Вымойте ячейки с помощью 1x DPBS.
Затем добавляют 1,5 миллилитра 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу T75 и инкубируют в течение четырех минут при 37 градусах Цельсия, чтобы удалить облученный и инактивированный фибробласт 3T3 из культуры. Промыть колбу T75 1x DPBS дважды, чтобы тщательно смыть оставшиеся фибробласты 3T3. Добавьте 1,5 миллилитра 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу T75 и инкубируйте в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия, чтобы отсоединить ГНЭ.
Нейтрализуют трипсин ингибитором соевого трипсина в соотношении один к одному. Центрифугируйте клетки в 500 раз ги в течение пяти минут. Затем отбросьте супернатант и промойте клетки пятью миллилитрами расширительной среды один раз.
Клетки теперь готовы к посеву для выращивания органоидов. Разморозьте органоидную культуру внеклеточного матрикса или ECM на ночь при четырех градусах Цельсия. Охлаждает 15-луночный ангиогенез скользит ночью при той же температуре.
Далее охладите кончики пипетки до четырех градусов Цельсия. Покройте горки пятью микролитрами холодного 100% ECM на льду. Поместите их в инкубатор клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия на срок не менее 30 минут для консолидации.
Подсчитайте ГНП, собранные из кокультуры, с помощью гемоцитометра. Затем разбавляют клетки до 500 клеток на микролитр в общем количестве, при этом 20% ECM разбавляются дифференцировочными средами на льду. Достаньте слайды с покрытием ECM из инкубатора и засейте пять микролитров смеси ECM холодных клеток в каждую из скважин.
Переложите слайды сразу же в инкубатор культуры при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа, чтобы закрепить смесь ECM клеток. После этого достаньте слайды из инкубатора и подайте клетки в каждую лунку 15-луночных слайдов ангиогенеза с 50 микролитрами дифференцировочной среды. Возвращают слайд в культурологический инкубатор при 37 градусах Цельсия, меняя среду через день, пока органоиды не будут готовы к дальнейшим экспериментам.
Предварительно обработайте 8-луночные стекла с дном камеры клеем в течение 30 минут. Выбросьте раствор и высушите лунки на воздухе еще 30 минут. Затем отбросьте среду из верхней части ECM, а затем добавьте 50 микролитров холодного 1x PBS в каждую скважину из 15-луночных слайдов на льду.
Пипетка вверх и вниз три-пять раз, используя 200 микролитров наконечника пипетки с большим отверстием. Распределите раствор по центру колодца 8-луночных камерных слайдов. Немедленно удалите лишнюю жидкость из колодцев с помощью пипетки с тонким наконечником.
Затем поместите камеру в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 40 минут, чтобы усилить органоид, прилипший к стеклянному дну. Через 40 минут аккуратно промыть органоиды 1x PBS дважды и зафиксировать их 300 микролитрами 4% параформальдегида в каждой лунке в течение 30 минут, установив комнатную температуру. Дважды промыть 1x PBS и хранить органоиды в 1x PBS установлено четыре градуса Цельсия для иммуноокрашения в течение двух недель.
Чтобы извлечь органоиды для гистологических исследований, удалите среду из культуры и добавьте 50 микролитров холодного одного 1x PBS в каждую лунку горок на льду. Пипетка вверх и вниз три-пять раз с помощью 200-микролитрового наконечника пипетки с большим отверстием. Объедините все растворы из 15-луночных слайдов или культуральных вставок в 15-миллилитровую коническую трубку на льду.
Отрегулируйте общий объем раствора в трубке до 10 миллилитров, добавив холодный 1x PBS. Центрифугируйте трубку при четырех градусах Цельсия, 300 раз в г в течение пяти минут. Затем аспирируйте супернатант и добавьте 60 микролитров теплого гистогеля для смешивания с органоидной гранулой, используя 200 микролитровый наконечник пипетки с большим отверстием.
Сразу же перенесите суспензию на гистологическую форму. После консолидации гистогеля при комнатной температуре поместите блок формы в 4% параформальдегид для фиксации на ночь при четырех градусах Цельсия. Откройте программное обеспечение и щелкните правой кнопкой мыши в нижней части экрана.
Затем выберите Элементы управления анализом, а затем Автоматизированные результаты измерений. Откройте органоидное изображение и выберите от 5 до 10 органоидов с видимыми просветами. Щелкните правой кнопкой мыши изображение, чтобы открыть меню, и выберите Полигональная рентабельность инвестиций, чтобы очертить весь органоид, чтобы получить общую площадь поверхности органоида.
Затем наметьте просвет, чтобы получить площадь просвета. Повторите это для оставшихся органоидов в лунке и всех лунок в анализе. Наконец, экспортируйте данные в Excel.
Разделите площадь просвета на общую площадь поверхности и усредните все органоиды из образца, чтобы получить базовый коэффициент просвета. Яркие полевые изображения представляют ГНЭ из успешной и неудачной коллекции образцов. ГНЭ хорошо растут в большом кластере.
Напротив, ГНП плохо растут в двух небольших кластерах, окружающих облученные клетки 3T3. Органоиды в 15-луночном слайде имеют более точные и четкие изображения, чем в культуральной вставке. Кроме того, в этих двух методах культивирования не наблюдалось существенных морфологических различий.
Органоиды, не относящиеся к МУКовисцидозу, обычно имеют больший просвет и больше жидкости, чем органоиды муковисцидоза. На этих изображениях показано окрашивание HNE в органоидах субъекта без CF, F508del/F508del, и иммунофлуоресцентное окрашивание ресничек в органоиде. Здесь показаны реснички, окрашенные ацетилированным тубулином, вторичным антителом, меченым FITC, и ядрами, помеченными DAPI.
Здесь показаны максимальные проекционные изображения двух репрезентативных органоидов путем иммунофлуоресцентного окрашивания с цельным креплением и соответствующие им трехмерные реконструкционные изображения. Показана слизь и реснички в просвете органоидов. Графические изображения представляют собой индуцированный форсколином анализ отека для проверки функции CFTR на первичных эпителиальных клетках носа.
Здесь показан репрезентативный эксперимент с дозой и реакцией форсколина у добровольцев, не страдающих муковисцидозом. Доза-реакция FSK сравнивается со средним дробным изменением через один час по сравнению с восемью часами, что говорит о том, что восьмичасовой анализ может привести к более значительной разнице в отеках между различными дозами FSK, чем через один час. Область под кривой может показать незначительную разницу в отеке по сравнению со средним дробным изменением через восемь часов.
При попытке этой процедуры имейте в виду, что органоиды будут потеряны в процессе сбора, фиксации и окрашивания. Таким образом, тщательная осторожность должна быть предпринята на каждом этапе, и должны быть получены достаточные стартовые цифры для обеспечения успеха. Выращивание органоидов в культуральных вставках может помочь в этом отношении, так как эти методы разрабатываются.
Здесь мы использовали коммерчески доступные реагенты и расходные материалы, чтобы облегчить распространение на других исследователей. Также был разработан функциональный анализ, в котором использовались общие методы микроскопа и более специализированное оборудование.
