Адгезивные клетки оказывают силы на свое окружение, и эти силы включают силы, которые клетки оказывают на субстрат, показанный здесь зеленым цветом, и силы, которые клетки оказывают на своих соседей, показанные красным цветом. Эти силы могут быть измерены в клеточных монослоях с использованием метода, называемого монослойной стрессовой микроскопией. Вкратце, метод включает в себя приготовление гидрогелей, содержащих крошечные флуоресцентные бусины, прямо под верхней поверхностью, и большие флуоресцентные бусины, которые приклеиваются к стеклу.
На этом гидрогеле человек видит клетки и культивирует их до слияния или любого другого состояния, в котором он хочет измерить силы. Измерение сил требует визуализации клеточного монослоя, получения переданных световых изображений клеток и флуоресцентных световых изображений крошечных и больших шариков. Каждый из этих образов приобретается в одной и той же вокальной плоскости.
Эти изображения получаются, когда клетки прикреплены и отделены от гидрогеля. И сравнение этих двух наборов изображений дает нам данные, необходимые для количественной оценки всех этих сил. Вот где AcTrM и AnViM вступают в игру.
После того, как вы накладываете ячейки, чтобы вы могли получить изображения в том же самом месте, в любом желаемом экземпляре, этот протокол программируется в AcTrM, а затем для последующего анализа этих данных и визуализации результатов, что является целью AnViM. В ближайшие несколько минут мы проведем вас через процесс получения изображений для монослоя сливающейся ячейки. Нулевой шаг действия предлагает пользователю выбрать тип приобретения.
Новое приобретение, чтобы начать новый эксперимент, или продолжение приобретения, чтобы возобновить более ранний эксперимент. Щелкните Новое приобретение, чтобы создать список вакансий. На первом шаге действия перечислены все ваши следующие шаги.
И эти действия будут предприняты в окне списка позиций этапа здесь. Щелкните Live в Micro-Manager, чтобы визуализировать образец для ручной настройки. В режиме реального времени мы рассмотрим этот этап.
Здесь все понятно. Теперь нужно будет посмотреть на бусины. Здесь бусины можно визуализировать в флуоресценции.
Поэтому выберите канал, подходящий для верхних бусин. Также важно, чтобы вы могли увидеть несколько нижних бусин, поэтому давайте посмотрим на канал для нижних бусин. То, что вы видите здесь, - это размытое изображение нижних бусин, и это совершенно нормально, если вы можете сказать, что нижние бусины там, что вы можете на этом изображении.
Список позиций, нажмите кнопку Пометить. Так создается список вакансий. После создания списка позиций, который обсуждался в предыдущем видео, выполните действия, перечисленные во втором шаге действия, используя многомерное окно получения.
Допустим, мы хотим выполнять длительный таймлапс. Здесь я собираюсь указать количество изображений, которые мы хотим сделать. Первый канал будет фазовым каналом.
Следующая будет из верхних бусин, а следующая будет нижней. Нажмите кнопку Закрыть в многомерном окне получения и нажмите кнопку ОК на втором шаге AcTrM. Выходные данные будут сохранены в каталоге, указанном в окне многомерного сбора.
Третий шаг действия спросит, нуждается ли эксперимент в восстановлении. Ответ, как правило, будет положительным. Здесь iTACS спрашивает, хотим ли мы выполнить уточненное восстановление?
Эта первая часть приблизит нас к утонченному восстановлению, но нижняя часть еще больше приблизит нас к более высокой точности позиционирования. Если восстановление будет выполнено с использованием ограниченного поля зрения, этот вариант предлагается, но для этого эксперимента мы не будем выбирать этот вариант. На этом этапе получение набора эталонных изображений завершено, и Micro-Manager может быть закрыт.
Для получения изображений запустится AcTrM. Выберите увеличение и каталог, содержащий папки данных. Выберите варианты перемещения пластины вместе с каналом, используемым для перемещения.
Предусмотрен интерфейс для сопоставления того, что в данный момент видно в камере, с сохраненными изображениями. Если есть перекрытие, изображения будут отображать красный и зеленый цвет вместе с черным, и может быть выполнена ручная настройка. В противном случае нажмите «Принять», и приобретение продолжится.
Теперь мы можем начать ФИДЖИ. Выберите первый параметр в раскрывающемся меню MSM с надписью Предварительная обработка. Затем выберите папку, содержащую папку tnimgs.
Далее нам предстоит определить, какой канал соответствует какому изображению. Для этого примера канал 0 представляет собой проходящее световое изображение, которое является фазоконтрастным изображением клеток. Нижнее изображение бусины — это Канал 2, а верхнее изображение бусины — Канал 1.
И затем он спрашивает вас, где клетки пересекаются и с какой стороны изображения. В этом случае ячейки представляют собой монослой, продвигающийся к правому краю, поэтому мы отменим выбор Right и продолжим. Здесь небольшая область верхних бусин, расположенная далеко от монослоя, служит той же цели, что и изображения нижних бусин, которые будут казаться более редкими и большими, чем те, которые показаны здесь.
Теперь он спрашивает нас, хотим ли мы изменить яркость и контрастность, чтобы бусины выглядели на видном месте. Поэтому мы настраиваем с помощью ползунков в меню, и как только бусины появятся заметными, нажмите OK. А теперь сделаем коррекцию позиции. Если произойдет какой-либо сдвиг, он избавится от него.
И после того, как это будет сделано, он создаст папку анализа. Внутри папки анализа он создаст папку position, P0, и выбор, который мы сделали в предыдущих меню предварительной обработки, хранится в вариантах анализа, таких как какие края были пересечены, размер пикселя и какое изображение является фазовым контрастом и другие. В раскрывающемся меню монослойная стрессовая микроскопия или МСМ выберите деформация геля МСМ.
Отсюда мы выберем вариант, который подходит для нашей дистрибуции бисера. И по мере обработки данных вы можете видеть, что в папке position появилась новая папка перемещения. Здесь будут храниться все выходные файлы.
Это указывает на то, что анализ завершен. Мы рассмотрим, как вычислить силы, которые проявляются через клеточно-ECM-соединение и клеточно-клеточный переход, а также цитоскелет отдельных клеток монослоя. Для этого выберите третий вариант.
И вы выберете каталог, который содержит tnimgs и папку analysis, что означает, что вы выберете пример каталога, а не любой из этих каталогов. Нажмите select, и он спросит вас, каков модуль сдвига этого геля? Модуль сдвига составляет 1250, а толщина гидрогеля в этом примере составляет 118 микрон.
Ожидаемый уровень шума приведен здесь. Тогда есть среднее смещение нулевого флага, который не проверяется в данном случае. Выберите OK, и реализация, которая вычисляет тягу, выполняется через функцию MATLAB, как она реализована в этой версии AnViM.
Теперь он готов к расчету для клеточно-клеточных или цитоскелетных сил. И первый вопрос, который нужно задать: является ли монослой сливающимся? В этом конкретном случае у нас есть наступающий монослой, и в правой части кадра нет области ячейки.
Таким образом, ответ заключается в том, что монослой не сливается, поэтому мы собираемся сказать «нет». Теперь нас просят нарисовать многоугольник вокруг самого большого неячеистого объекта. Подбираем подходящие методы сегментации.
Здесь нас просят указать цвет клеток в методах три и четыре, поэтому здесь клетки черные, поэтому мы выберем черный. Сегментация, полученная из этих различных способов, заканчивается некоторыми отверстиями в монослое ячейки и некоторыми белыми областями в области без ячейки. Здесь мы можем выбирать, заполнять пятна автоматически и нажимать OK.So теперь все пятна заполняются в монослое и без области ячейки.
Затем мы вычислим механические напряжения в клеточном монослое. Мы уже выполнили первую часть, где мы сегментировали клетки из области без клеток, поэтому мы начинаем этот шаг со второй части, которая является сегментацией отдельных клеток и изображений. Один из них будет выбирать сегментацию для отдельных клеток.
И здесь он просит нас выбрать каталог позиций. И есть еще некоторая информация, приведенная здесь для этих параметров. Затем он просит вас нарисовать многоугольник вокруг наименьшей нормальной ячейки.
Таким образом, то, что вы рисуете здесь, используется для вычисления площади, и это будет оговаривать, что все, что меньше этого, не определяется как ячейка. А далее он просит самую большую ячейку. Итак, мы рисуем многоугольник вокруг самой большой нормальной ячейки, а затем он спрашивает, какой из них ярче?
Является ли интерфейс ячейка-ячейка ярче или клеточные центры ярче? Таким образом, в этом случае интерфейс ячейка-ячейка ярче, поэтому я собираюсь выбрать интерфейс ячейка-ячейка. Таким образом, это указывает на то, что расчет завершен.
Начнем с выбора карты интенсивности ячеек. Во-первых, iTACS просит пользователя выбрать каталог position, который также известен как папка P0. По завершении нажмите кнопку Выбрать.
Затем пользователя спрашивают, хочет ли он или она, чтобы iTACS обнаруживал деление клеток или количественно оценивал клеточную флуоресценцию. В этом случае у нас нет флуоресцентных белков внутри клетки, поэтому мы выберем обнаружение деления клеток. Следующий слайд позволяет пользователю определить размер соседней области, это уникальный анализ, который выполняет AnViM, где он рассматривает свойства отдельных ячеек, а также свойства соседних ячеек.
Здесь пользователь может выбрать ширину ячейки соседней области. В этом случае мы определяем соседние области с 60 пикселями. Первый флажок спрашивает, хотим ли мы, чтобы iTACS собирал свойства ячеек, да, мы это делаем, и этот флажок спрашивает, хотим ли мы, чтобы iTACS собирал свойства соседей, да, мы хотим, чтобы iTACS также делал это.
Под этими флажками iTACS предоставляет дополнительные сведения о флажках, если пользователь хочет получить более подробную информацию о каждом флажке. Это указывает на то, что анализ завершен. Опять же, iTACS просит пользователя выбрать каталог позиций.
Затем пользователю предоставляется выбор для отображения данных о силе, создания изображений данных о силе, отображения данных о скорости и создания изображений данных о скорости. Важно отметить, что создание изображений требует времени, поэтому можно сделать это сейчас или подождать, чтобы сделать это позже. Вот почему пользователю предоставляется возможность выбирать варианты или нет.
Здесь iTACS просит пользователя снова определить размер соседнего региона, и вы можете использовать тот же размер, который вы определили для отображения интенсивностей, который в нашем случае составлял 60 пикселей. И снова пользователю предлагается собрать свойства ячеек, а также соседней области. Это указывает на то, что анализ завершен.
В раскрывающемся меню монослойная стрессовая микроскопия или MSM выберите данные отслеживания результатов. Во-первых, iTACS просит пользователя выбрать каталог position, который также известен как папка P0. По завершении нажмите кнопку Выбрать.
Здесь iTACS спрашивает, с какого номера кадра пользователь хочет, чтобы iTACS начал отслеживать данные. Довольно безопасно начинать отслеживание с кадра номер два, потому что скорость не может быть определена для кадра номер один. Здесь iTACS просит пользователя указать максимальное количество участков для одновременного заполнения.
И, по сути, это способ ускорить отслеживание данных. По завершении нажмите кнопку ОК, и параметры выбора переменных во время отслеживания будут представлены аналогично параметрам создания тепловых карт. Общие свойства, представляющие интерес, приведены в текстовом поле в верхней части окна.
Но если вы хотите настроить свои переменные, вам просто нужно удалить все в текстовом поле и выбрать конкретные свойства, перечисленные ниже. В однослойной стрессовой микроскопии или раскрывающемся меню МСМ выберите график результатов. После этого iTACS спрашивает пользователя, хочет ли пользователь ограничить построение ячеек с непрерывным треком.
Если вы не хотите ограничивать построение непрерывными дорожками, нажмите кнопку Нет.Но если вы хотите ограничить построение ячеек с непрерывными дорожками, нажмите кнопку Да Здесь iTACS спрашивает, сколько переменных пользователь хочет, чтобы программа отображала. iTACS способен строить до трех переменных, и в этом случае мы построим только две переменные, чтобы увидеть связь между этими факторами. В однослойной стрессовой микроскопии или выпадающем меню МСМ выберите рисунок результатов.
Вот каталог позиций, и по завершении нажмите кнопку Выбрать. Затем iTACS просит нас выбрать начальный кадр. Здесь мы выбрали кадр номер два.
Варианты создания тепловых карт представлены аналогично вариантам построения временных треков отдельных ячеек. На этом мы делаем вывод, как сделать тепловую карту. Здесь представлен временной след клеточной скорости в цитоскелетном напряжении для клетки номер один.
Свойства отображаются на общей вертикальной оси, а горизонтальная ось указывает номер экземпляра времени, где кадры приобретаются с интервалом в 15 минут. Второй выход представляет собой массив тепловых карт через час после начала эксперимента. Свойства, показанные здесь, включают область распространения, ориентацию, цикличность, скорость, направление движения, ориентацию максимального напряжения, цитоскелетное напряжение, стяжение субстрата и анизотропию напряжения отдельных клеток.
Итак, это взгляд на один набор экспериментов. Существует несколько других экспериментальных ситуаций, когда AnViM и AcTrM могут помочь пользователю провести эксперимент воспроизводимо, и эти контакты перечислены в рукописи. Некоторые из ключевых особенностей iTACS включают автоматизацию экспериментального протокола, автоматизированный анализ данных, и не требуется никакого инженерного опыта.
