НАСГ является одним из самых важных хронических заболеваний печени в мире. Он может прогрессировать до фиброза, цирроза и, в конечном итоге, рака печени. Изучение динамических изменений ECM в НАСГ может помочь лучше понять фиброз.
Традиционная для визуализации визуализация не может продемонстрировать изменения структуры 3D ECM, что ограничивает понимание процесса динамического ремоделирования ECM при фиброзе печени. Для начала взвесьте мышь перед процедурой. После обезболивания мышь побрейте вентральную область с помощью машинки для стрижки волос и продезинфицируйте кожу 70% этанолом.
Положите мышь на спину и обездвижите ноги на хирургической доске скотчем. Используйте ножницы Майонеза и щипцы Адсона, чтобы сделать трехсантиметровый разрез сбоку в нижней части живота. А затем пятисантиметровый разрез по вертикали от нижней части живота до мечевидного отростка без вскрытия грудной полости.
После вскрытия брюшины аккуратно поместите кишечник слева от животного и поднимите правую долю печени с помощью аппликатора с вискозным наконечником, чтобы обнажить воротную вену. Чтобы катетеризировать воротную вену, введите внутривенный катетер 24 калибра в дистальный конец воротной вены. Поместите наконечник катетера до того, как воротная вена разветвится в печеночные доли.
Извлеките иглу сразу после того, как катетер войдет в вену. Убедитесь, что катетер правильно расположен внутри вены, перфузируя печень PBS с помощью шприца объемом один миллилитр через катетер. Используйте микрощипцы Dumont, микроиглу Castroviejo и шов 4-0, чтобы наложить шов ниже разветвления воротной вены, и второй шов на сантиметр ниже, чтобы закрепить катетер.
Подсоедините катетер к силиконовой трубке длиной один метр, внутренним диаметром три миллиметра и внешним диаметром 4,1 миллиметра с помощью соединителя для приманки. Подсоедините силиконовую трубку к перистальтическому насосу и резервуару с деионизированной водой. Осторожно удалите пузырьки воздуха внутри трубки и избегайте образования новых пузырьков во время перфузии.
Установите перистальтический насос на производительность 0.2 миллилитра в минуту. Сначала залейте деионизированной водой в течение двух часов, и цвет печени изменится с красного на желтый во время перфузии. Переключите перфузионный раствор на 0,5% дезоксихолата натрия и продолжайте в течение ночи, и печень станет белой в конце перфузии.
Переключите перфузионный раствор на деионизированную воду и перфузируйте в течение двух часов. Используйте микрощипцы Dumont и микроножницы, чтобы собрать децеллюляризированную печень и тщательно вымыть ее в чашке Петри с PBS. Перенесите небольшой кусочек децеллюляризированной печени на предметное стекло микроскопа и поместите ткань посередине.
Добавьте 10 микролитров антибактериальной монтажной среды в ткань с помощью пипетки, чтобы избежать высыхания ткани. Накройте ткань покровным стеклом и приложите небольшое усилие, чтобы сплющить образец. Заклейте края покровного стекла бесцветным и прозрачным лаком для ногтей.
Поместите каплю иммерсионного масла на верхнюю часть покровного стекла и поместите предметное стекло на держатель предметного стекла микроскопа. Опустите 20-кратную масляную линзу объектива до тех пор, пока она не соприкоснется с иммерсионным маслом. Переключитесь на фиолетовый канал с длиной волны 405 нанометров.
Включите затвор и сфокусируйте образец. Перемещайтесь и позиционируйте интересующую область для визуализации. Выключите затвор, прежде чем переходить к получению изображения с помощью лазерного излучения.
Чтобы запустить двухфотонный лазер, переключитесь на компьютерное управление и сначала включите двухфотонный лазер. Затем включите двухфотонный лазерный контроллер и затвор, убедившись, что выходная мощность превышает 2.5 Вт. Уменьшите мощность лазера, чтобы предотвратить гашение флуоресценции.
Выберите и отрегулируйте детекторы, как фотоумножители, так и гибридные, чтобы приспособиться к выбранным флуорофорам. Выберите одновременное или последовательное получение изображений. Отрегулируйте точечное отверстие до максимального значения.
Отрегулируйте длины волн лазера, усиление, мощность, смещение времени выдержки пикселя, усреднение размера пикселя и масштабирование. Прокрутите контроллер Z компьютера и установите размеры Z. Определите начальную и конечную точки и выберите количество изображений, предоставляемых в томе.
Получение изображений. После выполнения двухфотонной микроскопии коллагеновые волокна без децеллюляризации выявили изображение коллагеновой сети с низким разрешением. В децеллюляризованном внеклеточном матриксе наблюдались явные различия в морфологии и пространственном распределении между печенью чау-чау и фаст-фуда.
Коллагеновые волокна и мыши на диете чау-чау демонстрировали переплетение и хорошо организованную сеть, тогда как мыши на диете быстрого питания демонстрировали коллагеновые пучки с меньшей связностью. Трехмерная структура внеклеточного матрикса печени показывает, что коллагеновые волокна у мышей на диете чау-чау показали хорошо организованную сеть, но не у мышей с диетой быстрого питания. Для подтверждения качества фибриллярного коллагена в децеллюляризированном внеклеточном матриксе предметные стекла окрашивали гематоксилином эозином и пикросириусом красным.
Гематоксилин и эозин показывают, что все клетки были удалены. На изображениях окрашивания Picrosirius в красный цвет внеклеточный матрикс мышей, которых кормили чау-чау, выявил хорошо организованную сеть. И, напротив, мыши на диете быстрого питания показали более плотные коллагеновые волокна.
Аккуратно удалите пузырь внутри трубки перед перфузией. Пузырь закупорит сосуд в печени и повлияет на перфузию.
