Этот протокол позволяет визуализировать эмбрионы мышей по мере их развития. Это позволяет детально изучить ранний кардиогенез. Подобно неподвижным изображениям поддельных эмбрионов, живая визуализация дает полный доступ к изучению динамического процесса развития эмбриона.
Навыки, необходимые для визуализации жизни, трудно понять из текстовой публикации. Наблюдение за тем, как это делает другой человек, очень важно учиться. Для начала отрежьте кусочки вольфрамовой проволоки длиной в один сантиметр и заточите их до диаметра от 0,02 до 0,05 миллиметра, погрузив наконечник проволоки в насыщенный раствор нитрата натрия.
Чтобы подготовить локтевые стеклянные капилляры, поместите среднюю точку стандартного миллиметрового стеклянного капилляра над зажигалкой Бунзена на три-шесть секунд, медленно тяну с обоих концов, пока капилляр не станет тонким и гибким. Затем разорвите капилляр пополам и кратковременно нагрейте его, чтобы получить согнутие на 90 градусов в двух сантиметрах от кончика. Распилил кусок полиметилметакрилата размером примерно семь миллиметров в длину, четыре миллиметра в ширину и два миллиметра в толщину.
Удерживайте деталь метакрилата с помощью настольных тисков, затем просверлите индивидуальные отверстия поперек всей детали. Медленно вращайте дрель, применяя низкое, но постоянное давление. Используйте мелкий напильник, чтобы сгладить край держателя и отрегулировать его размер.
Кроме того, создайте небольшой наклон по краям держателя, чтобы облегчить позиционирование эмбриона. Готовый держатель поместите в посуду с дистиллированной водой, чтобы промыть его. Под стереомикроскопом проверьте держатель, чтобы убедиться, что отверстия содержат буровую пыль.
Если пыль присутствует, используйте вольфрамовые иглы для ее удаления. Чтобы стерилизовать держатель, поместите его в коническую трубку, наполненную дистиллированной водой, и обрабатывайте ультразвуком в течение 20 минут с выходной мощностью не менее 20 Вт. Извлеките матку из усыпленного эмбриона на 6,75-7,5 день беременной мыши и поместите ее на сухую и чистую бумажную салфетку.
Затем разрежьте матку, вставив кончик тонких ножниц со стороны мезометрии, и скользите лезвием, чтобы обнажить децидуи, и перенесите их в среду для рассечения. Препарируют эмбрионы, сохраняя эктоплацентарный конус нетронутым. Затем снимите мембрану Рейхтера, оставив часть ее на внеэмбриональной области.
Чтобы диссекция оставалась средней, заменяйте ее каждые 10 минут. Кроме того, препарируйте децидуи группами по три-четыре человека, а остальные храните в диссекционной среде, помещенной в ванну с температурой 37 градусов по Цельсию. Немедленно поместите рассеченные эмбрионы в питательную среду.
Выберите эмбрионы с желаемыми признаками флуоресценции с помощью флуоресцентного стереомикроскопа и поместите их в пробирку с питательной средой в инкубаторе клеточных культур для восстановления в течение двух часов перед визуализацией. После включения всех компонентов микроскопа, включая компьютер, программное обеспечение и лазеры, включите контроллер углекислого газа и установите его на 7%Поместите каплю силиконовой смазки с высоким вакуумом на 35-миллиметровую тарелку со стеклянной крышкой. Поместите держатель поверх капли и аккуратно нажмите, чтобы обездвижить его.
Для крепления эмбрионов перенесите два-три эмбриона из инкубатора в посуду с держателем. Используя пару щипцов и коническую вольфрамовую иглу, установите эмбрионы в отверстия. Используйте иглу, чтобы зацепить эмбрион за эктоплацентарный конус и вставить его в отверстие соответствующего размера.
Осторожно переместите чашку с эмбрионами и держатель на пластину микроскопа. Опустите объектив до тех пор, пока на границе раздела среднего объектива не образуется жидкий мениск. Поместив эмбрион в фокус, установите инкубационную камеру и заклейте ее вокруг объектива с помощью ленты.
Используя захват в реальном времени с помощью управляющего программного обеспечения микроскопа, отрегулируйте выходную мощность лазера и уровни усиления. Затем покройте среду парафиновым маслом, медленно капнув его на объектив. Настройте покадровую запись.
Установите интервал от пяти до 10 минут с интервалом Z от трех до пяти микрон между стеками. Оставьте пустое место в верхней части Z-Stack, чтобы предвидеть рост эмбриона. Минимум 50 микрон, добавляя 30 микрон за каждый час, захват не будет контролироваться.
Включите опцию автоматического сохранения, чтобы разрешить наблюдение за съемкой с компьютера, чтобы при необходимости можно было настроить размер Z-стека в соответствии с интересующей областью в фокусе. Показано развитие сердца живого эмбриона всего тела с помощью многофотонной визуализации. На эмбриональный день 7,5 венозная флуоресценция присутствует во всей нервной эктодерме с несколькими положительными ядрами в спланхнической и внеэмбриональной мезодерме.
Через четыре часа эндотелиальные предшественники активируют венозный и собираются, образуя эндокардиальную трубку и нижележащие аорты, которые через семь часов становятся замкнутыми структурами. Будьте осторожны при снятии мембраны Рейхтера. Он может действительно прилипнуть к эмбриону, особенно на предваряющих стадиях.
Во время удаления старайтесь защемить мембрану за лишнюю эмбриональную область.
