Для изучения механических и химических повреждений роговицы были созданы модели на животных ex vivo и in vivo. Этот метод предоставляет исследователям легко создаваемую платформу для изучения механических и химических повреждений роговицы. Чтобы создать эпителиальную рану роговицы мыши, отметьте центральную роговицу анестезированной мыши с помощью пуансона биопсии кожи, чтобы подтвердить хорошо очерченную и хорошо измеримую область раны.
Аккуратно вдавите пуансон на центральную роговицу, чтобы оставить круглую отметку. Удалите эпителий роговицы до слоя Боумена с помощью ручного кольца для удаления ржавчины роговицы с 0.5-миллиметровым заусенцем, гарантирующим, что слой Боумена не повредится. Удалите остатки рыхлых тканей на краю раны с помощью роговичных щипцов. Подтвердите область санации флуоресцентным окрашиванием, поместив каплю физиологического раствора на флуоресцеиновую бумагу для растворения флуоресцеина, а затем поместив содержащую флуоресцеин каплю на дефект эпителия мыши, чтобы визуализировать его под кобальтовым синим светом.
Приступайте к культуре ex vivo модели ссадины роговицы мыши, осторожно нажимая на верхний и нижний орбитальные края усыпленных мышей, чтобы вытолкнуть глазное яблоко. Введите кончик закрытых ножниц роговицы в ретробульбарное пространство вдоль нижней орбитальной стенки, чтобы не проникнуть в глазное яблоко. Удерживайте глазное яблоко неподвижно с помощью 0,3-миллиметровых щипцов роговицы, а затем разрежьте зрительный нерв и периорбитальные мягкие ткани ножницами роговицы, чтобы изолировать глазное яблоко.
Для культивирования глазных яблок мышей ex vivo подготовьте 48-луночную пластину с расплавленным воском внутри лунки и дождитесь затвердевания, затем кончиком щипцов конъюнктивы создайте круглое отверстие на поверхности затвердевшего воска для размещения глазных яблок. Поместите собранные глазные яблоки прямо на 48-луночную пластину с покрытым воском дном и боковинами, чтобы установить стабилизацию. Посев глазных яблок с помощью DMEM, содержащего 1% эмбриональной бычьей сыворотки с антибиотиками или без них, в зависимости от цели исследования.
Погрузите поверхность глаза в питательную среду, не вызывая всплытия глазного яблока, и задокументируйте ход заживления ран путем окрашивания флуоресцеином и сбора фотографий с помощью цифровой камеры под кобальтовым синим светом. Чтобы вызвать щелочной ожог, поместите круглую фильтровальную бумагу диаметром 8 миллиметров в чашку Петри. Используя пипетку, добавьте 0,5 нормального гидроксида натрия в чашку Петри, чтобы пропитать фильтровальную бумагу, и слейте излишки раствора из фильтровальной бумаги, прежде чем помещать их на анестезированную роговицу кролика.
После открытия век зеркалом век убедитесь, что мигательная мембрана кролика не мешает вставке фильтровальной бумаги, и поместите пропитанную щелочью фильтровальную бумагу на центральную роговицу на 30 секунд. Снимите фильтровальную бумагу и промойте поверхность глаза 10 миллилитрами физиологического раствора, чтобы смыть щелочной материал. Чтобы завершить дефект роговицы, удалите эпителий роговицы в пределах ушной области до мембраны Боумена с помощью средства для удаления ржавчины роговицы.
Подтвердите область санации флуоресцеиновым окрашиванием под кобальтовым синим светом и удалите остаточный эпителий роговицы с помощью щипцов роговицы. Чтобы обезопасить состояние раны при тарзоррафии, убедитесь, что мигательная мембрана гладко покрывает глазную поверхность и дефект эпителия роговицы со стороны носа. Выполните временную тарзорафию с местными средствами или без них, используя шов 6-0, чтобы защитить глазную поверхность и предотвратить ее расчесывание кроликом, убедитесь, что шов для тарсоррафии находится на расстоянии от 3 до 4 миллиметров от краев верхнего и нижнего века с четырьмя-пятью завязками и более длинными узлами, чтобы кролик не разорвал швы.
В модели заживления ран эпителия роговицы мыши ex vivo наблюдалась слегка вдавленная центральная область роговицы с положительным флуоресцеиновым окрашиванием в центральных двух миллиметрах после обработки эпителия роговицы мыши in vivo. Культура ex vivo мышиных глазных яблок, закрепленная на покрытой воском 48-луночной культуральной пластине, исследовалась и ежедневно документировалась на 48-луночной культуральной пластине под стереомикроскопом. Через сутки после удаления мышиного эпителия роговицы на цифровых фотографиях, полученных под кобальтовым синим светом, был выявлен один круговой дефект эпителия, окрашенный флуоресцеином, диаметром 2 миллиметра.
После создания щелочного повреждения эпителия роговицы кролика наблюдалось положительное окрашивание флуоресцеином с кобальтовым синим светом или без него над центральной роговицей с четким и полным круглым краем. Реэпителизация эпителиальной раны роговицы с врастанием паннуса наблюдалась из лимба. Наиболее важными шагами являются процедуры по созданию гладких и ровных эпителиальных дефектов на поверхности роговицы мышей и кроликов.
На этих платформах можно тестировать новые медицинские и хирургические терапевтические средства. Эффект повторной эпителизации можно контролировать после процедур. Неоваскуляризация роговицы и помутнение после травмы в этом протоколе были бы неудовлетворенной потребностью в дальнейших исследованиях.
