Этот протокол важен тем, что является отличной моделью для изучения воспаления роговицы и его вклада в заживление ран в нормальных и патологических условиях. Основным преимуществом данной методики является то, что она создает точную и воспроизводимую эпителиальную рану без нарушения базальной мембраны. Эта модель намоталивания роговицы проста и быстра в исполнении.
Продемонстрировать процедуру будет принц Аковуа, аспирант из моей лаборатории. Для начала приготовьте 1%-образный раствор флуоресцеина, растворив 10 миллиграммов натриевой флуоресцеиновой соли в одном миллилитре стерильного физиологического раствора или PBS. Затем для анестезии приготовьте 10 миллилитров коктейля кетамина-ксилазина, смешав два миллилитра кетамина, один миллилитр ксилазина и семь миллилитров стерильного PBS.
После обезболивания 8-12-недельной черной мыши C57 6 дикого типа оцените глубину анестезии, оценив рефлекс педали после защемления пальца ноги. Чтобы создать эпителиальную рану роговицы, поместите анестезированную мышь под расслоительный микроскоп. Наматывайте только правый или левый глаз и сохраняйте консистенцию при ранении глаза при переходе от мыши к мыши.
Держите глаз широко открытым, удерживая веки большим и указательным пальцами. Затем, используя стерильный трефин диаметром два миллиметра, разграничить центр роговицы и осторожно закрутить трефин, чтобы произвести впечатление на эпителий роговицы. Не применяйте чрезмерного давления, так как это может привести к перфорации роговицы.
Затем, удерживая стерильный тупой клюшку для гольфа под углом примерно 45 градусов от поверхности роговицы, опустошайте эпителий путем осторожного и непрерывного соскабливания в демаркированной области с использованием шпица. Не применяйте чрезмерную силу и поддерживайте гидратацию, используя стерильный PBS, если это необходимо. Для контроля закрытия раны и повторной эпителизации пипетку от 1 до 1,5 микролитров 1% флуоресцеина раствора на травмированную поверхность и визуализируют роговицу с помощью цифрового микроскопа с источником синего света.
Представьте себе раненую роговицу в определенное время после ранения. Сделайте снимки в течение первой минуты добавления флуоресцеинового раствора, чтобы избежать распространения раствора на окружающий эпителий, что может привести к переоценке размера раны. Затем, используя программное обеспечение для анализа изображений, проследите область раны и выразите область раны в каждый момент времени в процентах от исходной площади раны в нулевой час.
Просвечивающая электронная микрофотография раны роговицы показывает, что базальная мембрана эпителия остается неповрежденной даже после травмы. У 8-12-недельных мышей дикого типа закрытие раны происходит через 24 часа после ранения. Воспалительная реакция на ранение характеризуется визуализацией клеток в лимбе.
Здесь показана лимбальная сосудистая система неперемотанной роговицы с внесосудистыми нейтрофилами и травмированной роговицы с внесосудистыми тромбоцитами и нейтрофилами через 30 часов после истирания. Чтобы успешно воспроизвести этот протокол, необходимо использовать один и тот же штамм в каждом диапазоне мыши, а размер и глубина раны должны быть созданы, как описано.
