Протокол, описанный в этом видео, определит экспериментальные процедуры, необходимые для визуализации распространяющихся клеток в размерах в течение жизни, и использование вычислительного инструмента, который количественно определяет динамику распространения клеток в беспристрастной и автоматизированной манере. Актив распространения клеток позволяет непрерывно отслеживать движение края клетки и морфологические изменения во время распространения клеток, что является особенностью, которая отсутствует в большинстве существующих анализов распространения клеток. Также этот протокол реализует использование автоматизированной компьютерной обработки и анализа, предоставляя информацию о круговороте клеток, области и циклах опрокидывания вытягивания распространяющих клеток.
Такая автоматизированная обработка уменьшает предвзятость в анализе данных и обеспечивает надежный метод анализа динамики распространения клеток для большого количества ячеек. В сочетании с медикаментозным лечением или генной наукой и методами, этот протокол является подложным для крупномасштабных скоростей молекулярных игроков, регулирующих клеточные выступы. Для данного протокола, клетки, используемые мыши эмбриональных фибробластов, которые генетически кодировать PH-Akt-GFP, что позволяет флуоресцентные пометки плазменной мембраны.
До начала клеточного распространения анализа, культура блюдо клеток до 90% слияния. После того, как клетки достигли надлежащего слияния, пламя 22 на 22 миллиметра крышку скольжения и поместить его в 35 миллиметров клеточной культуры блюдо. Пальто крышку скольжения с фибронектином, который был разбавлен в PBS до концентрации 2,5 микрограмма на миллилитр.
Поместите блюдо с крышкой скольжения в 37 градусов инкубатор в течение одного часа. После одного часа аспирировать фибронектин убедившись, что не прикасаться к крышке скольжения с наконечником пипетки. Вымойте блюдо с PBS, аккуратно трубы вокруг крышки скольжения два-три раза.
Для посева клеток, начните с аспирации клеточной культуры средств массовой информации из блюда клеток. После этого вымойте блюдо теплым PBS. Добавьте в блюдо 650 микролитров трипсина ЭДТА и наклоните блюдо, чтобы равномерно распределить фермент.
Поместите блюдо с трипсином в инкубатор на одну минуту. После инкубации вам сначала нужно будет добавить 10 миллилитров средств массовой информации клеточной культуры в центрифугу трубки. Затем, быстро добавить еще 10 миллилитров средств массовой информации в блюдо для того, чтобы утолить трипсина.
Чтобы разбавить клетки, которые будут посеяны на крышке скольжения, пипетка один миллилитр содержимого блюда в центрифугу трубки. Из трубки пипетка примерно от 500 до 1000 микролитров разбавленных клеток попадает в тарелку с крышкой скольжения. Убедитесь, что крышка скольжения на 10% слияния или 50000 клеток на миллилитр и регулировать объем разбавленных клеток по мере необходимости.
Целью этих ячеек является создание плоскости фокусировки во время получения изображения. С остальными клетками в тарелке, прохождение одной пятой клеток в одну маленькую тарелку за лечение. Это будут клетки, которые будут проанализированы для распространения динамики.
Поместите проход блюда и крышка скольжения блюдо в инкубатор в течение восьми до 24 часов. Чтобы проверить важность Arp2/3 для распространения клеток, сначала добавьте пять миллилитров средств массовой информации клеточной культуры в контроль и трубку центрифуги лечения. Далее добавьте 20 миллилитров dmem, что не хватает фенола красный в каждом из двух больших трубок центрифуги.
Pipette либо препарат CK-666, который является ингибитором комплекса Arp2/3 или контролируемой терапии, такие как DMSO в малых и больших труб. Чтобы начать фармакологическое лечение клеток, удалите проходные блюда, которые инкубируются на ночь. Аспирировать клеточной культуры средств массовой информации из всех блюд и мыть посуду с теплым PBS.
Возьмите небольшие трубки, содержащие либо CK-666 или контроля дополнительных средств массовой информации и добавить содержимое соответствующей трубки в каждом из прохода блюда. Этикетка каждого из блюд с правильной медикаментозной обработки, а затем поместить блюда обратно в инкубатор в течение дополнительного часа После одного часа инкубации, аспирировать препарат дополняет средства массовой информации из каждого из блюд. Далее, добавить теплый PBS для всех блюд для того, чтобы тщательно удалить все оставшиеся фенол красные средства массовой информации.
Добавьте 230 микролитров трипсина EDTA и поместите блюда в инкубатор на одну минуту. Удалить трипсинизированные блюда из инкубатора и приступить к добавить пять миллилитров препарата дополняет dmem, что не хватает фенола красный в трубку, обозначенную как трубка B.Then добавить еще пять миллилитров тех же средств массовой информации в соответствующее блюдо, чтобы утолить трипсина. Pipette средств массовой информации вверх и вниз несколько раз для того, чтобы отделить все клетки от блюда.
Перенесите все содержимое блюда в другую трубку, которая уже была обозначена как трубка A.In для подготовки разбавления клеток, что подходит для визуализации, передать один миллилитр клеток из трубки А в трубку B.Повторить все шаги разбавления для каждого лечения. Поместите все трубки в инкубатор на 45 минут, чтобы клетки восстанавливаются после трипсинизации. Убедитесь, что все части клеточной магнитной камеры, которые могут вместить 22 на 22 миллиметра крышки скольжения были тщательно очищены перед использованием.
Удалите блюдо с крышкой скольжения из инкубатора. Аспирировать клеточной культуры средств массовой информации и мыть крышку скольжения с теплой PBS. Снимите крышку скольжения с помощью пары типсов и аккуратно положите крышку скольжения на нижнюю пластину магнитной камеры.
Затем возьмите силиконовую прокладку и поместите ее на верхнюю часть крышки скольжения. Прикрепите основное тело магнитной камеры к нижней пластине. Добавьте один миллилитр dmem без фенола красного цвета, соответствующий соответствующей обработке в магнитной камере.
Возьмите ткань без ворса и тщательно мазок корпус между основным телом и нижней пластины для того, чтобы проверить на наличие утечек. Чтобы завершить магнитную камеру, опустите прозрачную крышку на основной корпус. Наконец протрите дно крышки скольжения с тканью распыляется с водой, а другой распыляется с 70%этанола.
Разогреть верхний инкубатор конфокального микроскопа до 37 градусов. Поместите магнитную камеру поверх цели. Перед приобретением динамики распространения, установите фокус на уже поляризованные клетки в зеленом флуоресцентном канале.
Это гарантирует, что распространяющиеся ячейки будут в фокусе, как только они прикреплятся к крышке скольжения. Удалите прозрачную крышку магнитной камеры и пипетки 500 микролитров из трубки B, которая была удалена из инкубатора. Поместите прозрачную крышку обратно на вершине.
Для идентификации клеток идеально подходит для клеточного распространения анализа поиска зеленых гало, которые представляют клетки, которые до сих пор не прикреплены к крышке скольжения или находятся на самых ранних стадиях вложения. Приобретайте изображения и сохраните файлы. После завершения изображения приобретения ячейки распространения, начните с запуска совместимых Python IDE, таких как Spyder.
Для вычислительного анализа динамики распространения ячеев найдите и откройте файл графического интерфейса, распространяющий ячейку, предусмотренный в соответствующих пакетах скриптов. Нажмите кнопку запуска, которая откроет панель графического интерфейса анализа в фоновом режиме. В графическом интерфейсе находятся все настройки, необходимые для анализа.
Для анализа области ячейки и круговорота ввемите файл приобретения и необходимые настройки в вкладке области распространения ячейки. Корректировки должны быть сделаны в зависимости от типа ячейки и параметров приобретения изображения. После нажатия запуска скрипт создаст круговорот ячейки и область по сравнению с графиком времени для всех распространяющихся ячеек.
Для получения данных кимографа нажмите на вкладку генератора и анализа кимографа. Этот анализ требует обрезки входных файлов с стеками изображений одной ячейки. После вставки всех настроек и нажатия запуска скрипт создаст несколько кимографов для данной ячейки.
Слева находятся репрезентативные ячейки из лечения DMSO и CK-666, автоматически сегментированные с использованием предоставленного скрипта. В отличие от изотропной и высоко круглой морфологии, продемонстрированой контрольными клетками, ингибируется Arp2/3 клетки обладают снижением круговорота. Кроме того, автоматически генерируемые кимографы обеспечивают временное разрешение, которое имеет решающее значение для понимания динамики выступов.
Контрольные клетки выступают настойчиво практически без опровержений. В отличие от этого, ингибирование Arp2/3 нарушает стабильность выступов, о чем свидетельствует увеличение событий опровержения на протяжении всего распространения. Это видео должно предоставить вам понимание того, как правильно семян клеток, выполнять фармакологические методы лечения и подготовить изображения и вычислительные инструменты, необходимые для количественной оценки динамики распространения клеток.
Этот протокол можно далее сочетать с цитоскелетной флуоресцентной визуализацией и миграционными анализами для выявления молекулярных игроков, управляющих клеточными выступами. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.
