Клеточные массивы микротрубочек содержат субпопуляции микротрубочек с различными динамическими свойствами, необходимыми для функционирования. В этом протоколе рассматривается вопрос о том, как коллективная деятельность регуляторов наделяет проксимальные субпопуляции микротрубочек различными свойствами. Этот анализ реституции снизу вверх позволяет нам одновременно визуализировать организацию и динамику проксимальных популяций микротрубочек, таких как одиночные микротрубочки и пучки, и расшифровать механизмы, лежащие в основе их самоорганизации.
Многокомпонентное восстановление требует оптимизации экспериментальных параметров, таких как pH, ионная сила и концентрация белка при сохранении активности каждого из них. Систематический анализ отдельных компонентов перед многобелковыми анализами чрезвычайно полезен. Для начала пипетка смеси из 4,5 микролитров BRB ADDTT в одном микролитре раствора микротрубочки на предметное стекло микроскопа.
Накройте крышкой размером 18 на 18 миллиметров и запечатайте края либо прозрачным лаком для ногтей, либо герметиком VALAP. Поместите цель TIRF под крышкой. Визуализируйте вновь полимеризованные микротрубочки на длине волны, соответствующей флуоресцентно меченому тубулину в яркой смеси, чтобы определить, какое разбавление микротрубочек использовать в предстоящих экспериментах.
Определить интенсивность лазера для эксперимента эмпирически таким образом, чтобы все флуоресцентные белки освещались, но не подвергались значительному фотоотбеливанию в течение времени эксперимента. Установите температуру микроскопа на 28 градусов Цельсия для просмотра динамических микротрубочек. Используйте бумагу для линз для очистки объектива 100X с 70% этанолом.
Используйте наилучшую комбинацию фильтрующих кубов и эмиссионных фильтров в зависимости от флуоресцентных каналов, которые будут визуализированы. Настройте последовательность изображений. Для эксперимента с 647-нанометровыми флуорофорами, мечеными биотинилированными микротрубочками, 560-нанометровыми флуорофорами, мечеными небиотинилированными микротрубочками в растворимом тубулине, и интересующим белком, меченым GFP, изображайте 488-нанометровые, 560-нанометровые и 647 нанометровые каналы каждые 10 секунд в течение 20 минут.
Чтобы захватить эталонное изображение пучков до добавления растворимого тубулина и белка, связанного с микротрубочками, создали последовательность с одним изображением каждый в каналах длиной волны 560 нанометров и 647 нанометров. Проверьте положение лазерного луча на потолке над микроскопом и внесите изменения в луч с помощью программного обеспечения. Убедитесь, что лазерный осветитель выровнен.
Перед визуализацией добавьте каплю погружного масла микроскопа к объективу. Приготовьте растворимую тубулиновую смесь, держа ее на льду, и раскрутите смесь. Чтобы обездвижить микротрубочки через связь биотин-нейтравидин-биотин, сначала протоите примерно в 7,5 микролитрах раствора НейтрАвидина до тех пор, пока камера не будет заполнена и инкубируется в течение пяти минут.
Мойте 10 микролитрами МБ холода. Протойте в 7,5 микролитрах блокирующего белка KC и инкубируйте в течение двух минут. Промыть 10 микролитрами МБ тепла, чтобы подготовить камеру к введению микротрубочек.
Разбавьте запас биотинилированных микротрубочек в BRB ADDTT и добавьте один микролитр этого разведения к девяти микролитрам МБ теплого. Перетейте смесь в камеру и инкубируйте в течение 10 минут. Смойте неиммобилизованные микротрубочки с 10 микролитрами МБ тепла.
Влить в камеру 7,5 микролитров теплого KC и инкубировать в течение двух минут. Во время инкубации готовят два наномолярных раствора сшивки или белка PRC1 в KC и раскручивают раствор вниз. Пропустите 10 микролитров этого раствора в камеру визуализации и инкубируйте в течение пяти минут.
Для изготовления пучков влейте в камеру 10 микролитров небиотинилированных микротрубочек и инкубируйте в течение 10 минут. Дважды промыть камеру 10 микролитрами МБ тепла. В течение 10-минутного инкубационного времени подготовьте 10 микролитров пробирной смеси, содержащей интересующие белки, растворимый тубулин, нуклеотиды, поглотители кислорода и антиоксиданты, и раскрутите ее вниз.
Держите смесь на льду. Загрузите подготовленную камеру визуализации, приклеенную к держателю слайда на объективе 100X TIRF. Используйте 560-нанометровый и 647-нанометровый каналы, чтобы найти поле зрения, содержащее оптимальное количество и плотность одиночных микротрубочек и пучков.
После определения поля зрения сделайте эталонное изображение. Осторожно течь в пробирную смесь, не нарушая камеру визуализации. Запечатайте открытые концы камеры герметиком VALAP.
Понаблюдайте за микротрубочками и начните последовательность визуализации. После иммобилизации семян микротрубочек и генерации пучков были получены флуоресцентные изображения. Одиночные микротрубочки были идентифицированы флуоресцентным сигналом в 647-нанометровом канале, тогда как микротрубочки были идентифицированы как предварительно сформированные пучки, когда они отображали флуоресцентные сигналы в обоих каналах.
Изучена динамика одиночных микротрубочек и сшитых пучков PRC1 в присутствии белков KIF4A и CLASP1, что показало, что одиночные микротрубочки удлиняются в ходе анализа, тогда как рост сшитых микротрубочек застопорился. Будьте осторожны, чтобы держать полимеризованные микротрубочки при комнатной температуре или выше. Держите растворимый тубулин на льду и защищайте камеру визуализации и флуоресцентно меченые микротрубочки и белки от света.
Эти анализы дали механистическое представление о том, как белковый модуль, обнаруженный в митотическом веретене, может дифференциально регулировать динамику двух различных популяций микротрубочек, которые сосуществуют в веретене.
