Этот протокол использует все основные особенности AFM, не податные другим методам одной молекулы. В результате мы можем разрешить структуру нуклеосомы в наномасштабе. Важно отметить, что прямая визуализация нуклеосом была сделана в физиологических условиях.
Используя нашу технику AFM, мы недавно выявили уникальные свойства центромерной нуклеосомы, которые могут играть определенную роль в функции всего центромера. Метод, который будет показан в настоящее время применяется в нашей лаборатории для исследования самосборки белков, связанных с образованием амилоидных агрегатов. Эти белковые агрегаты вызывают развитие разрушительных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, чтобы назвать несколько.
Простые методы подготовки применимы и к другим белково-ДНК-комплексам, включая крупные системы, такие как механизм репликации ДНК. Хотя некоторые изменения необходимы. Для того, чтобы охарактеризовать нуклеосомные частицы на уровне одной молекулы с помощью статической и замедленной атомной микроскопии силы, начните с очистки, сборки и проверки нуклеосом, описанных в сопроводительном текстовом протоколе.
Затем подготовь поверхность слюды для статического изображения AFM. Для этого сначала подготовь пятьдесят миллимолярдов APS фондового раствора в деионизированной воде. Храните один миллилитр aliquots этого решения при четырех градусах по Цельсию, пока это не необходимо.
Из фондового раствора подготовьй рабочий раствор APS для модификации слюды, растворив 50 микролитров 50 микромоляных АПС в 15 миллилитров дистионизированной воды. Смешайте раствор, а затем заполнить cuvette с раствором. Далее вырежьте одну на три сантиметра полоски слюды из высококачественных листов слюды.
Убедитесь, что кусок подходит при размещении по диагонали в кювет. Затем расщепляются слои слюды до тех пор, пока обе стороны не будут свежевыжаты, а кусок тонкий, как 0,1 миллиметра. Немедленно поместите кусок слюды в заполненный APS кюветт и инкубировать слюду в течение 30 минут.
Перенесите кусочек слюды в кюветт, наполненный дистиллированной деионизированной водой, и замочите его в течение 30 секунд. Затем используйте аргон, чтобы полностью высушить обе стороны полосы Слюды APS. Нанесите двойную клейкую ленту на несколько магнитных шайб и поместите их в сторону.
Затем разрежьте субстрат APS mica до одного сантиметра на один сантиметр квадрата и накройте их чистой чашкой Петри. Затем приготовьте три разбавления собранных нуклеосом с помощью фильтрованного буфера 0,22 микрона, содержащего 10 миллимолярновых гепов и четыре миллимолярных хлорида магния при PH 7,5. Чтобы ограничить потерю нуклеосом, при низкой конечной концентрации, разбавление должно быть сделано по одному, непосредственно перед осаждением на слюде APS.
Депозит от пяти до 10 микролитров каждого нуклеосомы образца в центре части Mica APS и пусть инкубировать в течение двух минут. Затем аккуратно промойте образец двумя-тремя миллилитров дистиллированной деионизированной воды для удаления буферных компонентов. И высушить отложенный образец под легким потоком аргона.
Для начала смонтировать наконечник на кончике держателя установки AFM. Затем смонтировать первый образец на сцене AFM, будьте осторожны, чтобы не связаться с поверхностью образца. Распоить лазер над кантилевером до тех пор, пока его сумма не будет на максимуме, и отрегулируйте вертикальные и боковое значения отклонения почти до нуля.
Затем настройте зонд AFM, чтобы найти его резонансную частоту, отрегулируйте амплитуду привода и установите размер изображения до 100 на 100 нанометров. После настройки нажмите кнопку engage, чтобы начать подход. Когда подход будет завершен, постепенно оптимизируйте точку амплитуды до тех пор, пока поверхность образца не будет хорошо видны.
Затем увеличьте размер сканирования до одного микрона на один микрон и разрешение до 512 на 512 пикселей. Наконец, нажмите кнопку захвата, чтобы начать захват изображения. Используйте клей сканера стеклянных стержней, чтобы прикрепить стеклянный стержень к этапу сканера AFM.
Дайте этому высохнуть в течение как минимум 10 минут. В то же время, сделать 0,1 миллиметра толщиной круглые кусочки слюды с диаметром 1,5 миллиметра, пробивая их из большего листа слюды. Используйте высокоскоростной AFM слюды стеклянный стержень клей, чтобы прикрепить этот кусок слюды на стеклянный стержень на высокой скорости AFM, и позволить ему оставаться нетронутым в течение как минимум 10 минут, пока он высыхает.
Затем расщепляйте слои из слюды с помощью чувствительной к давлению ленты до тех пор, пока на ленте не будет виден хорошо расщепленный слой. Затем разбавьте один микролитр из 50 миллимолярной АПС в 99 микролитров дистиллированной деионизированной воды, чтобы сделать 500 микромолярный раствор APS. Депозит 2,5 микролитров раствора на свежевыжатой поверхности слюды и дайте поверхности функционировать в течение 30 минут.
После инкубации, промыть слюду несколько раз дистиллированной деионизированной водой, применяя три микролитров полоскания. Удалите воду полностью после каждого полоскания, поместив нетканые салфетки на краю слюды. После окончательного полоскания поместите три микролитера дистиллированной деионизированной воды на поверхность, и дайте ему сидеть в течение как минимум пяти минут, чтобы удалить любые не специально связанные APS.
Затем поместите зонд в держатель AFM на высокой скорости и поместите держатель на сцене AFM с наконечником вверх. Промыть держатель с помощью 100 микролитров дистиллированной деионизированной воды, а затем два 100 микролитров полоскания 0,22 микрона фильтруется нуклеосомы изображения буфера. С промывки сделано, заполнить камеру с 100 микролитров нуклеосомы изображения буфера, погружая кончик.
Отрегулируйте положение кантилевера до тех пор, пока он не будет поражен лазером. Затем смойте APS mica пять раз с помощью фильтрованного нуклеосомного буфера изображения, используя четыре микролитров на полоскание. Разбавить один микролитер нуклеосомного сборочного запаса в 250 микролитров фильтрованного нуклеосомного буфера изображения для окончательной нуклеосомной концентрации одного наномоляра.
Депозит 2,5 микролитров этого разбавления на поверхность и дайте ему сидеть в течение двух минут. Промыть поверхность дважды с четырьмя микролитров нуклеосомы изображения буфера, чтобы избежать более скученной. После окончательного полоскания оставьте поверхность, покрытую буфером изображений.
Установите сканер и образец поверх держателя наконечника так, чтобы образец был лицом вниз. Для начала подхода используйте функцию автоматического подхода с амплитудой точки набора, близкой к свободной амплитуде колебаний. Отрегулируйте установленную точку до тех пор, пока поверхность не будет хорошо отслеживаться.
Затем установите площадь изображения около 150 на 150 нанометров до 200 на 200 нанометров со скоростью сбора данных около 300 миллисекунд на кадр изображения. В качестве управления для сборки и осаждения, H3 мононуклеозомы были подготовлены и изображены с помощью статических AFM. Это изображение обеспечивает снимок нуклеосомы населения, как она существовала моменты до осаждения, подтверждающие, что nucelosomes были успешно собраны.
С успешной сборкой управления H3 представленные методы были затем применены к изучению нуклеосом CENP-A. Статические изображения AFM этого образца показали, что его сборка была успешной. Из статических изображений AFM можно охарактеризовать высоту и число поворотов мононуклеосом.
Для определения количества поворотов ДНК в индивидуальной нуклеосоме используется как угол между свободными руками ДНК, так и длина свободных рук ДНК. В отличие от этого, промежуток времени AFM изображения нуклеосомы могут быть использованы для визуализации общего спонтанного разворачивания поведение нуклеосом. По мере уменьшения числа нуклеосомы наблюдается соответствующее уменьшение нуклеосомного объема ядра.
В дополнение к обычной визуализации промежуток времени, высокая скорость промежуток времени AFM может быть использован для зондирования более сложной нуклеосомы динамики, которая пропущена с помощью стандартной визуализации промежуток времени. Способность этого метода захвата динамики в течение длительного периода времени была необходима для визуализации дальнего транслокации нуклеосомного ядра CENP-A, которое было захвачено в течение 1200 кадров. Этот метод также имеет решающее значение для захвата редкой передачи нуклеосомного ядра CENP-A из одного субстрата ДНК в другой.
Быстрая скорость захвата изображения сделала визуализацию этого динамического события возможной, так как для этого потребовалось всего несколько кадров. В широком поле хроматина есть ряд важных вопросов, связанных с ролями лигерных гистонов и гистонового увеличения хроматиновой динамики. На все эти вопросы можно ответить с помощью нашей техники.
