Наш новый протокол помогает различать и количественно оценивать три статуса трубчатых колец, таких как стабильные микротрубочки, лабильные микротрубочки и свободные канальцы в тканях животных. Этот метод состоит из простых шагов и позволяет оценить структурную стабильность трубок, которая не может быть обнаружена путем количественной оценки трубок после трансляционной модификации. Этот метод имеет важное значение для исследования и разработки терапевтических способов лечения заболеваний, где стабильность микротрубочек имеет решающее значение, таких как болезнь Альцгеймера и рак.
Начните процедуру с подготовки лабораторного белья к рассечению тканей. Наполните коробку колотым льдом и поставьте на нее две чашки Петри. Наполните одну посуду ледяным раствором фосфатного буфера или ПБС для кратковременного мытья и хранения рассеченных тканей.
На вторую посуду постелите фильтровальную бумагу, смоченную ПБС. Затем взвесьте 1,5-миллилитровые микропробирки, заполненные PBS, для хранения рассеченных тканей. После извлечения тканей из усыпленной мыши переложите их в пробирки и повторно взвесьте каждую микропробирку.
Переместите ткани в стеклянный гомогенизатор с ледяным стабилизирующим буфером из микротрубочек или MSB + среда и немедленно гомогенизируйте ткань с помощью охлажденного гомогенизатора. Теперь переложите гомогенат ткани в двухмиллилитровую микропробирку с помощью пипетки Пастера и центрифуги при 2,400 G в течение трех минут при двух градусах Цельсия. Перелейте надосадочную жидкость в новую микропробирку объемом 1,5 миллилитра для удаления мусора.
Вбейте надосадочную жидкость или фракцию S1 в новую микропробирку объемом 1,5 миллилитра. Сразу же пипетку 200 микролитров фракции S1 переложить в центрифугаторную микропробирку и центрифугировать при 100 000 G с помощью ротора TLA-55 в течение 20 минут при температуре два градуса Цельсия. После второго центрифугирования отделите надосадочную жидкость S2 от осадка P2.
Сразу же переложите все количество фракции S2 в центрифугируемую микропробирку и с помощью ротора TLA-120.2 открутите ее при 500 000 G в течение 60 минут при температуре два градуса Цельсия. После третьего центрифугирования отделите надосадочную жидкость S3 от осадка P3. Растворите всю фракцию S3 в 200 микролитрах 2X додецилсульфата натрия или буфера для образцов SDS.
Смешайте оставшиеся фракции S1 с равным объемом 2X буфера для образцов SDS для использования в качестве стандартной кривой для вестерн-блоттинга. Затем добавьте 400 микролитров буфера для образцов SDS в пробирки с фракциями P2 и P3. Затем кратковременно обработайте раствор ультразвуком, чтобы растворить осадок, прежде чем переложить образцы в новые 1,5-миллилитровые микропробирки и поместить их в холодильник.
Прокипятите все образцы при температуре 100 градусов Цельсия в течение трех минут. Микротрубочки во фракции P2 составляли 34,86% от общего количества альфа-тубулина в мозге мыши, в то время как микротрубочки во фракциях P3 и S3 составляли 56,13% и 9,01% соответственно. Процентное содержание бета-3 тубулина во фракциях Р2, Р3 и С3 достоверно не отличалось от содержания альфа-тубулина.
Фракция S2 показала ограниченное прохождение тубулина через ультрафильтрационную спиновую колонку мощностью 300 килодальтон, в то время как фракция S3 позволила полностью пройти тубулиновые комплексы. Хроматографическое разделение привело к 100-килодальтонному элюированию тубулина S3. В каждой фракции были обнаружены равные пропорции альфа- и бета-тубулина.
Фракции Р2 были значительно обогащены ацетилированным альфа-тубулином, в то время как тирозинированный альфа-тубулин доминировал во фракции Р3. Замораживание мозга перед гомогенизацией приводило к снижению концентрации альфа-тубулина во фракциях Р2. Однако альфа-тубулин увеличился во фракции Р3.
Замораживание также снижало уровень ацетилирования и повышало уровень тирозинизации альфа-тубулина во фракции Р2. Лечение нокодазолом снижало уровень альфа-тубулина во фракции Р2. В отличие от замораживания, нокодазол не влиял на посттрансляционные модификации Р2-тубулина.
В ткани головного мозга наблюдалась значительно более высокая концентрация Р2-тубулинов, тогда как Р3-тубулины были сконцентрированы в пролиферативной ткани. Вестерн-блоттинг показал, что Р2-тубулин, специфически обнаруженный в нервной системе, происходит из стабильных микротрубочек, а Р3-тубулин происходит из лабильных микротрубочек. Стабильность микротрубочек очень динамична.
Важно выполнить этот протокол быстро, без перерывов, в условиях низких температур. Также убедитесь, что ткани и фракции не были заморожены до растворения в буфере для образцов SDS. Ожидается, что сочетание иммунной презентации с использованием каждой фракции с протеомикой позволит выявить факторы, участвующие в динамике микротрубочек.
С помощью этого метода мы выявили, как нормальный тау существует на микротрубочках. Он также может быть использован для изучения того, как он становится ненормальным в старом мозге, чтобы идентифицировать новые лекарственные мишени деменции.
