Этот метод демонстрирует калибровку количественного количества белка в жидком образце с одномекуляторный процесс для подсчета. В частности, он может проиллюстрировать, как популяции белков могут быть флуоресцентно помечены на каждом уровне молекулы. Предыдущие методы проводили объемные измерения для анализа молярных соотношений флуоресцентных и белковых молекул, но они не могут выявить, как неоднородно популяции белков на самом деле помечены.
Наши методы могут делать это непосредственно на уровне одной молекулы. Наш метод может быть распространен на сверхчувствительные и передовые молекулярно-концентрационные анализы, что приведет к будущим диагностическим методам, позволяющим эффективно делать выводы о патогенных молекулах в образцах. Наш метод может быть применен к анализу отдельных видов белка с использованием флуоресцентных антител, а также к анализу нескольких видов с использованием неспецифических этикеток для всех белков, разделенных электрофорезом или хроматографией.
Наиболее важным моментом метода является получение воспроизводимости данных. Я рекомендую держать то же экспериментальное состояние как можно больше при измерении нескольких образцов. Визуальная демонстрация этого метода обеспечит, как сделать каждый экспериментальный шаг стабильным и воспроизводимым.
Он также покажет некоторые необычные шаг в биохимии протоколов, таких как спин-покрытие и мытье микроскопа coverslips. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте обливий буфер и 1%Tween-20, как указано в текстовом протоколе. Используйте гидроксид натрия, чтобы настроить рН до 12.
Смешайте 100 микролитров лизайного буфера с одним микролитером одного молярного ДДТ и четырьмя микролитров 50%CHAPS. Добавьте один микролитер готовой клеточной культуры и гомогенизируйте раствор, медленно трубя, чтобы избежать пузырьков. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение пяти минут с нежным возбуждением.
Затем рехомогенизировать раствор, медленно промокая его вверх и вниз. Добавьте один микрограмм ester красителя Cy3 NHS и гомогенизируйте раствор, замедляя трубчатые трубы, чтобы избежать пузырьков. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут с нежным возбуждением.
Повторите этот процесс, добавляя одинаковое количество красителя и инкубации образца один раз. Добавьте 100 микролитров 0,8 молярного гидроксида HEPES-натрия, чтобы настроить рН раствора до 7,2 и утолить реакцию. Медленно пипетки вверх и вниз, чтобы гомогенизировать раствор.
Далее добавьте 20 микролитров биотина-2-амина и пять микролитров ЭОК. Гомогенизировать раствор, трубя вверх и вниз медленно. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение одного часа с нежным возбуждением.
После этого используйте ультрафильтрационный столбец с 10-килограммовым вырезом, чтобы удалить неотредактированные реагенты маркировки и сконцентрировать образец. После выполнения стандартного SDS-PAGE для образца белка и молекулярной лестницы, изображение геля для определения местоположения белковых полос. Используйте острый лезвие, чтобы вырезать гель части, которые включают белковые фракции интереса на основе bands'locations.
Во-первых, установлены крышки толщиной 22 миллиметра на 22 миллиметра и толщиной 0,15 миллиметра. Используйте плазменный очиститель, чтобы подвергать крышки плазме воздуха в течение одной минуты, чтобы очистить и активировать их поверхности. Далее, используйте спин пальто, чтобы вращать пальто coverslips с 200 микролитров буфера авадина в течение пяти секунд при 500RPM, а затем 30 секунд при 1000RPM.
Инкубировать крышки при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы дать им высохнуть. Чтобы подготовить крышки для образца белка, используйте образец белка, который был разбавлен. Поместите 100 микролитров разбавленного образца на центр крышки с покрытием авадина.
Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Чтобы подготовить положительный контроль, поместите 100 микролитров очищенного флуоресцентного биотина в пять микромолейных гидроксида HEPES-натрия при рН 7.2 в центре крышки с авадином покрытием. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут.
Для подготовки отрицательного контроля, спин пальто плазмы coverslips с 200 микролитров из пяти HEPES-гидроксида натрия с двумя миллиграммами на миллилитр BSA без авадина. Добавьте 100 микролитров к очищенной флуоресцентной биотину в пяти микромоляных гидроксидах HEPES-натрия при рН 7.2. Инкубировать в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре.
После этого, промыть каждый coverslip с 200 микролитров дистиллированной воды путем трубопроводов по краям, убедившись, что не прикасайтесь к середине крышки с наконечником пипетки. Повторите эту стирку три раза. Затем, подвергать равное количество новых coverslips в плазме воздуха в течение одной минуты.
Поместите очищенный крышку поверх каждого образца связанных coverslip, чтобы избежать высыхания. Запустите широкое поле или evanescent поле флуоресценции микроскопа. Установите крышку на микроскоп и найдите фокус.
Затем выполните сканирование плитки, чтобы получить не менее 100 изображений. В этом исследовании, маркировка однородности каждого помеченного вида белка в клетках количественно после разделения с SDS-PAGE. Здесь видны необработанные данные изображений для различных молекулярных фракций белков из ликата клеток HeLa, а также положительные и отрицательные элементы управления.
Пока и образец протеина и положительный экспонат управления между 100 и 500 пятнами в изображение, отрицательный контроль exhibits очень немногие к никаким. Это показывает, что процесс достаточно подавляет неспецифическую привязку красителей к поверхности крышки. Гистограммы интенсивности пятна для образцов протеина и положительного управления представляют множественные пики, которые представляют стохастическое связывание красителей к главным amines в протеинах и структурах тетрамера avadin соответственно.
Все пятна показали мигание и пошаговую фотоотчет с непрерывным лазерным возбуждением, подчеркивая наблюдение на уровне одной молекулы. Заполняемость маркировки, или LO, затем рассчитывается из соотношения количества пятен в каждом образце белка к положительному контролю. LO измеряется из образца лизата клетки HeLa колеблется от 50% для меньшей молекулярной фракции веса, до 90% для более высокой молекулярной фракции веса.
LO для всего образца протеома без разделения считается 72%Очень важно использовать свежеприготовленные реагенты и избегать пыли, особенно во время подготовки coverslips. После этой процедуры, анализ подсчета одной молекулы в определенном объеме может быть выполнен для количественной оценки концентраций каждого белка. Например, анализ любого сырого продукта, или гель и капиллярные продукты электрофорез, могут быть выполнены.
Этот метод прокладывает путь для использования одной молекулы флуоресценции изображений молекулярной медицины, органической химии и анализа омиков. Преодолевая концепцию между концентрацией и числами. Концентрированный гидроксид натрия является коррозионным, и адекватную защиту следует носить при обращении с ним.
Кроме того, высокой мощности лазерного излучения может привести к повреждению глаз, так что защитные очки могут носить.
