Протокол описывает, как оценить лекарственное повреждение печени in vitro с использованием микрофизиологической системы, которая может поддерживать высокофункциональные и метаболически активные микроткани печени в течение четырех недель. Этот подход представляет собой специфическую для человека модель клеточной культуры для точного определения лекарственного повреждения печени для новых соединений, что является более прогностическим, чем более простые 2D-культуры или даже более сложные 3D-культуры. Этот метод может быть использован как часть батареи доклинических тестов безопасности, чтобы определить, безопасно ли соединение для начала клинической разработки.
Можно протестировать широкий спектр модальностей. Начните настройку микрофизиологической системы печени, подключив контроллер к стыковочной станции в инкубаторе клеточных культур. Убедитесь, что свежий осушитель добавлен в банку с осушителем, расположенную в задней части контроллера.
После включения контроллера нажатием переключателя лодочного качелька подождите пять минут, пока система стабилизируется и достигнет давления. Снимите каждую пластину с упаковки. Затем загрунтуйте каждую скважину, добавив 500 микролитров предварительно подогретой посевной усовершенствованной среды DMEM на сторону резервуара.
Поместите водителя на док-станцию в инкубаторе. По завершении выберите основную программу на экране контроллера, пока жидкость не пройдет через опоры фильтра. Чтобы покрыть поверхностный канал, заполните все колодцы 1,1 миллилитрами посевной усовершенствованной DMEM среды.
После размещения водителей с пластинами в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа подключите док-станцию и запустите инкубационную программу. Оттаивайте флаконы PHH и HJC, удерживая флаконы на водяной бане с температурой 37 градусов цельсия, пока не останется только небольшой кусочек льда. После размораживания аккуратно пипеткуйте максимум два флакона PHH непосредственно в пробирку предварительно подогретой криоконсервированной среды восстановления гепатоцитов, среды CHRM.
Затем используйте один миллилитр CHRM для промывания оставшихся клеток из криотрубы. Пипетка ГКК осторожно из криотрубы в 10 миллилитров ледяного холодного посева усовершенствованной DMEM среды в 50-миллилитровой центрифужной трубке. Позже центрифугируют оба типа клеток отдельно при комнатной температуре при 100 G в течение 10 минут.
После центрифугирования удаляют супернатант и повторно суспендируют PHH в теплой посевной усовершенствованной среде DMEM и HKCs в ледяном холодном посеве усовершенствованной DMEM среды с использованием одного миллилитра на флакон клеток, добавленных в трубку. Повторно подвешивают клетки с мягким раскачивающим действием, а затем помещают на лед. При приостановке подсчитайте клетки и запишите жизнеспособность.
Жизнеспособность ячейки должна быть выше 85% Далее отсоедините водителя от док-станции и поместите водителя в шкаф микробиологической безопасности или MBSC. Затем аспирируйте среду сверху каркаса к точке остановки, каналу и резервуару, оставляя мертвый объем в 0,2 миллилитра в культуральном колодце, достигая чуть выше эшафота. Добавьте 400 микролитров продвинутой среды DMEM в камеру скважины, прежде чем вернуть водителя на стыковочную станцию в инкубаторе и запустить программу смены носителя в течение трех минут.
Через три минуты отключите драйвер от док-станции и поместите его обратно в MBSC. Аспирируйте среду от вышеуказанного каркаса вниз до точки остановки и в конце резервуара каждой скважины, а затем повторно подвешивайте PHH, осторожно раскачивая трубку и добавляя необходимый объем клеточной суспензии в каждую культуральную скважину. Осторожно пипеткой суспензию клеток, обеспечив равномерное рассеивание ячеек по каркасу пластины.
Осторожно повторно суспендируйте ГКК и добавьте клеточные суспензии в каждую культуру хорошо. После того, как все колодцы содержат оба типа клеток, поместите микрофизиологическую систему или драйвер MPS на док-станцию в инкубаторе без физического подключения, чтобы стоять в течение одного часа. По прошествии часа подключите водителя к док-станции и запустите программу seed.
Когда программа автоматически приостанавливается через две минуты, извлеките драйвер из инкубатора и медленно добавьте 1000 микролитров посевной усовершенствованной среды DMEM в канал для достижения общего объема 1,4 миллилитров. Позже переместите тарелки в инкубатор и запустите остальную часть семенной программы в течение восьми часов. На четвертый день приостановите программу на контроллере и отсоедините драйвер и пластину от док-станции.
Перенесите их в MBSC. Используйте пипетку, чтобы вручную собрать примерно один миллилитр среды из каждой лунки для анализа растворимых биомаркеров, не нарушая культуру клеток, касаясь каркаса. Пометьте собранный носитель как образцы четвертого дня и проведите анализы лактатдегидрогеназы и мочевины в качестве проверки контроля качества, чтобы убедиться, что посев был успешным.
Затем дозируйте каждую лунку в соответствии с планом пластины, выполняя смену среды. После завершения верните драйвер на док-станцию в инкубаторе и запустите инкубационную программу. На шестой день отсоедините водителя и пластину от док-станции и передайте на MBSC.
Используйте пипетку, чтобы собрать примерно один миллилитр среды из каждой скважины и пометить как 48-часовые образцы после дозы и хранить образцы при минус 80 градусах Цельсия для последующих анализов. На восьмой день удалите каркасы с пластин с помощью пары пинцетов и поместите каркасы в 24-луночную пластину, содержащую 500 микролитров DPBS без кальция и магния в каждой лунке, не нарушая микроткань. Делайте снимки каждого каркаса под перевернутым световым микроскопом с 10-кратным увеличением.
На четвертый день, перед введением препарата, была проведена контроль качества сформированных микротканей печени с высвобождением ЛДГ и синтезом мочевины. На восьмой день были оценены множественные показатели здоровья и печени, такие как альбумин, мочевина, CYP три А четыре, АТФ, чтобы подтвердить высокие уровни печеночной функциональности и воспроизводимости в микротканях. Контрастно-фазовая микроскопия и окрашивание ПЧ в микроткани печени выявили равномерное распределение ГКЦ в микротизируемых ПГГ.
Острое воздействие троглитазона на микроткани печени вызывало токсичность, которая была обнаружена аланинаминотрансферазой или АЛТ, а также высвобождение ЛДГ и быстрое снижение производства альбумина и мочевины. Содержание АТФ и активность CYP три А четыре подтвердили токсичность, вызванную троглитазоном, а значения EC50 были в значительной степени сопоставимы с другими конечными точками. Снимки ярко-полевой микроскопии, сделанные после восьмидневной культуры в MPS, показывают здоровую микротизсу печени, равномерно посеянную по всему каркасу в управлении транспортным средством.
Гибель или деградация тканей наблюдалась у реплик, получавших положительный контроль и троглитазон. Кроме того, была также исследована токсичность печени после воздействия пиоглитазона. Высвобождения ЛДГ или АЛТ обнаружено не было, однако через 48 часов наблюдалось умеренное снижение производства альбумина и мочевины.
Незначительное снижение содержания АТФ наблюдалось при высоких концентрациях пиоглитазона. Значения EC50 были получены на основе кривых реакции дозы. Микроскопия выявила незначительное изменение микротизвестности после 96 часов воздействия пиоглитазона в двух самых высоких испытанных концентрациях.
В исследовании использование клеток, имеющих хорошее качество и жизнеспособность выше 85%, имеет важное значение для создания высокофункциональных и здоровых 3D-микротизов в микрофизиологической системе. После этой процедуры мы можем оценить взаимодействие аденина и лекарственного средства и лекарственное повреждение печени на моделях заболеваний, таких как неалкогольный дельта-гепатит или неалкогольная модель жировой болезни печени, которая использует тройную культуру паренхиматозных и непаренхиматозных клеток печени.
