Генерация сфероидов печени человека с использованием аутологичных источников может способствовать различным областям исследований, таким как токсикология, рак и открытие лекарств. Основным преимуществом этого метода является использование человеческих гепатоцитов, полученных из BDPC, для создания сфероидов печени человека, обходя нехватку первичных гепатоцитов человека или PHH. Аутологичные сфероиды человека могут быть распространены на регенеративную медицину и терапию, особенно у пациентов с острой печеночной недостаточностью.
Продемонстрирует процедуру доктор Анна-Кэтрин Шотт, руководитель проекта в моей лаборатории. Начните с приготовления 500 миллилитров гепатобласта KnockOut сыворотки замещения диметилсульфоксида или среды KSR DMSO и среды для созревания гепатоцитов. Аликвотируйте среду из запаса и добавляйте свежий фактор роста гепатоцитов или HGF и онкостатин M или OCM в конечных концентрациях 10 или 20 нанограмм на миллилитр для каждой смены среды.
Трижды от 10 до пятого плюрипотентных стволовых клеток, полученных из крови, или клеток BD-PSCs переносят в четырехлуночную пластину, покрытую биоламинином, и инкубируют пластину в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение пяти дней. Чтобы поддержать энтодермальную дифференцировку, культивируйте клетки в течение пяти дней в среде гепатобласта KSR DMSO и меняйте среду каждые 48 часов. На пятый день добавьте среду для созревания гепатоцитов и культивируйте клетки в течение дополнительных семи-10 дней в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, обеспечивая смену среды каждые 48 часов.
Подсчитывают клетки с помощью счетной камеры и центрифуги BD дедифференцированной клеточной суспензии по 300 г в течение 10 мин при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости ресуспендировать дедифференцированные клетки BD в среде KSR DMSO в два раза по 10 из шести клеток на миллилитр концентрации. После обеспечения суспензии одной ячейки удалите лишний мусор, пропустив клетки через сетчатый фильтр ячейки размером 40 микрометров.
Опять же, подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры и подготовьте достаточный объем плотности посева каждой ячейки, чтобы распределить необходимый объем на лунку. Подготовьте градиент с верхним посевом в один миллион клеток до низкой плотности посева в 4 000 клеток. Затем распределите 100 микролитров среды KSR DMSO в 96-луночные пластины с низким креплением и добавьте 100 микролитров разбавления семян клеток.
Инкубируйте низкую насадочную пластину в течение пяти дней. Смените 50% среды на третий-четвертый день после посева, когда сфероиды станут достаточно компактными. На пятый день смените среду на среду созревания гепатоцитов и культивируйте в ней клетки еще от семи до 10 дней, меняя среду каждые 48 часов.
После культивирования клеток в течение 4, 8, 15 и 24 дней с использованием метода дифференцировки, описанного ранее, удаляют среду. Инкубируйте клетки с предварительно подогретыми фиксаторами, содержащими 4% параформальдегида, в PBS в течение 10 минут. Далее откажитесь от фиксатора и промойте клетки PBS два раза по пять минут каждый.
Немедленно добавьте 0,1% раствор Triton X-100 и пропекайте клетки в течение пяти минут перед двумя промывками PBS. Добавьте блокирующий раствор из PBS и 5% бычьего сывороточного альбумина или BSA, прежде чем поместить клетки на коромысло на один час при комнатной температуре. Разбавьте первичные антитела в буфере для разведения 1% BSA PBS и добавьте 50 микролитров разведения антител на лунку.
Откажитесь от раствора антител после часовой инкубации при комнатной температуре и дайте три промывания по пять минут каждое с использованием PBS. Добавьте 50 микролитров вторичных антител, разведенных в буфере для разведения, в каждую лунку и инкубируйте клетки в течение 30 минут при комнатной температуре. После трехкратной промывки ячеек PBS в течение пяти минут каждый установите покровные стекла с монтажными носителями, содержащими DAPI, для микроскопического анализа.
Осторожно выбросьте питательные среды, не касаясь сфероидов, добавьте свежеприготовленный PBS с 0,1% раствором Triton X-100 и инкубируйте в течение пяти минут, чтобы проникнуть в клетки. Промойте сфероиды два раза со средой, медленно пипетируя среду. Затем инкубируйте сфероиды с 50 микролитрами первичных антител в течение одного часа.
После этого осторожно удалите излишки раствора антител и трижды смывайте среду. Приготовьте соответствующие вторичные антитела, такие как козий антимышиный IgG Cy3, козий антимышиный IgG 488 и кролиководческий антикуриный IgG Texas Red в PBS с 1% BSA и добавьте 50 микролитров разбавления антител в лунку до 20 минут инкубации в инкубаторе углекислого газа. Снова трижды промойте со средой до 30 минут инкубации в инкубаторе.
Включите флуоресцентный источник света за 10 минут до использования. Включите компьютер и откройте программное обеспечение для работы с изображениями. Используйте цель 4-кратного увеличения, нажав кнопку 4X на панели инструментов, чтобы выбрать правильную масштабную линейку.
Затем поместите 96-луночную пластину на центральную пластину сцены. Включите светодиодный источник света, используйте фильтр яркого поля и установите пластину на интересующий колодец с помощью ручки регулировки ступени оси XY. Перейдите на световой путь камеры и нажмите кнопку в реальном времени в программном обеспечении для обработки изображений, чтобы визуализировать изображение на экране.
Убедитесь, что сфероид центрирован с помощью ручек оси XY, и сфокусируйтесь с помощью ручки грубой или тонкой фокусировки. Затем выберите метод наблюдения яркого поля на панели инструментов, установите автоматические настройки экспозиции и нажмите кнопку снимка на панели управления камерой, чтобы сделать снимок. Затем сохраните картинку в виде файла vsi, используя соответствующее имя в интересующей папке.
Поместите экранирующую пластину окружающего света, чтобы выключить светодиодную подсветку и заменить фильтр для возбуждения B. Затем выберите метод наблюдения 488. Откройте затвор, сделайте снимок, нажав кнопку моментального снимка, закройте затвор и сохраните файл как vsi.
Повторите процесс с фильтром для возбуждения G, чтобы повторить процесс для каждой интересующей скважины. Морфологические изменения в процессе дифференцировки печени показали, что BD-PSC дифференцировались в гепатоциты в три этапа. Первый этап представлял собой дифференцировку в энтодермальные клетки.
Вторая дифференцировка в клетки-предшественники печени, демонстрирующие типичную полигональную морфологию. И третье, созревание до гепатоцитов. Иммунофлуоресцентный анализ показал сильную экспрессию маркеров-предшественников энтодермы печени человека, таких как альфа-фетопротеин или APF и транстиретин или TTR, в клетках на первой стадии процесса дифференцировки печени на L4-8 день.
Однако их экспрессия снизилась на 15-й день. Экспрессия альбумина или ALB и четвертого ядерного фактора гепатоцитов альфа или HNF4 альфа появлялась сначала в L4, увеличивалась на протяжении всего времени дифференцировки от L4 до L15 и достигала сильной и стабильной экспрессии во время созревания от L15 до L24. Спонтанная агрегация клеток наблюдалась в пластинах с низким прикреплением, содержащих индукцию гепатоцитов или созревание среды, инициированной образованием сфероидов.
Наблюдалась последовательная корреляция между стероидным сфероидом и переменным числом клеток. Сфероиды, сформированные и дифференцированные в L14 и живые, окрашенные антителами, показали потенциальную функциональную активность сфероидов, полученных из BD-PSCs. Подготовка мононуклеарных клеток к перепрограммированию является наиболее важным этапом в этой процедуре.
Создание сфероидов печени человека является первым шагом к созданию органоидов in vitro, упрощенной версии органа в 3D с микроанатомией, аналогичной анатомии in vivo. Органоиды, созданные в лаборатории, используются для изучения органогенеза, развития заболеваний и питательных веществ.
