Наш протокол исследует разнообразие дрожжей и плесени в почве с использованием образцов почвы, полученных из разных климатических регионов. Это дает представление о разнообразии экологических дрожжей и помогает отслеживать патогенные виды. Протокол предлагает экономически эффективный и быстрый метод сбора дрожжей и плесени из почвы.
Образцы почвы могут быть полностью обработаны для получения изолятов всего за семь дней. Хорошо организованная экспериментальная установка, такая как маркировка культуральных трубок и подготовка среды за один день вперед, является ключом к тому, чтобы избежать чувства подавленности во время эксперимента. Начните с приготовления набора стерильных 13-миллилитровых культуральных пробирок.
Маркируя их идентификатором образца почвы, затем используйте серологическую пипетку, чтобы добавить пять миллилитров отвара дрожжей-пептона-декстрозы, дополненного хлорамфениколом и беномилом в каждую пробирку. Внутри шкафа биобезопасности для организмов второго уровня переложите приблизительно 0,1 грамма почвы в соответствующую культуральную трубку с помощью стерильного аппликатора с деревянным плоским наконечником. Надежно закройте трубку до первой остановки, предотвращая просыпание, обеспечивая при этом обмен воздуха во время инкубации.
Затем инкубируйте культуральные трубки в барабане в течение 24 часов при температуре, которая считается оптимальной для максимизации роста дрожжей. Затем маркируйте пластины с добавлением дрожжевого экстракта пептона-декстрозы с хлорамфениколом и беномилом с идентификатором образца почвы перед переносом супернатанта в твердую среду. Выньте культуральные трубки из барабана ролика.
Затем внутри шкафа биобезопасности для организмов второго уровня кратковременно вихрьте трубку, чтобы втянуть частицы почвы и клетки, которые, возможно, осели на дне, обратно в суспензию. Затем переложите 100 микролитров супернатанта на пластину с помощью микропипетки. Используйте стерильный многоразовый разбрасыватель клеток, чтобы распределить жидкость тщательно и равномерно по поверхности агара.
После обеспечения достаточного времени инкубации в два-три дня, осмотрите пластины на предмет роста дрожжей внутри шкафа биобезопасности для организмов второго уровня. Ищите кремовые, круглые, матовые дрожжи, которые можно легко отличить от бактериальных и плесневых колоний. Выберите одну дрожжеподобную колонию из каждой тарелки, используя стерильные деревянные палочки-аппликаторы с простым наконечником.
Переложите каждую выбранную колонию на свежий дрожжевой экстракт пептон-декстро-агаровые пластины, дополненные хлорамфениколом и беномилом и полосой для отдельных колоний. Выполните три отдельные полосы и используйте новый аппликатор для каждой полосы. Затем используйте свежие клетки, разработанные на пластине, для выполнения колониеполимеразной цепной реакции.
Используйте внутренние транскрибированные спейсеры ITS1 и ITS4 праймеров для усиления гена грибкового штрих-кодирования. Сравните полученную внутреннюю транскрибированную спейсерную последовательность штаммов дрожжей, две последовательности, депонированные в общедоступных базах данных, таких как Национальный центр биотехнологической информации GenBank и UNITE, чтобы установить видовую идентичность. Добавьте почву в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки, содержащие один миллилитр бульона декстрозы Сабуро, и высиживайте при 50 градусах Цельсия в течение двух-четырех дней.
Чтобы перенести мицелий из почвенного инокулированного бульона на агаровые пластины солодового экстракта, сначала определите почвенные прививки, которые имеют видимый рост мицелиальной кислоты, добавьте бульон декстрозы Сабуро к воздушной границе. Затем используйте стерилизованные деревянные палочки аппликатора с простым наконечником, чтобы перенести мицелий в центр агаровой пластины с солодовым экстрактом и инкубировать эти агаровые пластины с солодовым экстрактом, установленными на 37 градусов Цельсия в течение трех дней. Для селекции мицелия, обладающего морфологическими свойствами Aspergillus fumigatus, определите колонии плесени, которые имеют характерный зеленый покачивающийся рост.
Внутри шкафа биобезопасности для организмов второго уровня собирают конидии или мицелий, соскребая поверхность один раз с помощью стерилизованных деревянных аппликаторов с плоским наконечником или петли для прививки, и перекладывайте ее в центр агаровой пластины с солодовым экстрактом, нанося на агар для отдельных колоний. Инкубируйте пластины при 37 градусах Цельсия в течение двух дней. Используя стерильную палочку для нанесения или петлю прививки, субкультура одной колонии, генерируемой на солодовом экстракте агара, пронизывая колонию один раз.
Выложите собранные споры в центр пластины. Приготовьте стерильный 30%-ный раствор глицерина для сбора спор Aspergillus fumigatus или мицелия для хранения культуры. После двух дней инкубации агаровых пластин при 37 градусах Цельсия аспирировать один миллилитр 30%-ного раствора глицерина с помощью пипетки и диспергировать его на колонию Aspergillus fumigatus.
Для фенотипической идентификации штаммов Aspergillus fumigatus аспирировать 10 микролитров мицелиальных и споровых запасов добавить в 990 микролитров воды. Вихрь это разбавленная споровая суспензия и дозирование 10 микролитров суспензии на стандартный слайд микроскопа. Затем с помощью составного микроскопа при 400-кратном увеличении просмотрите суспензию и найдите конидиофоры.
Сравните наблюдаемую морфологию конидиофора с морфологией конидиофора Aspergillus fumigatus. Чтобы определить правильный размер фрагмента для каждого из девяти микроспутниковых локусов, используйте программное обеспечение, способное анализировать фрагменты. Извлеките необработанные данные, полученные из капиллярного электрофореза, и оцените размеры фрагментов на основе наибольшего пика с помощью программного обеспечения фрагментированного анализа.
Затем преобразуйте размеры фрагментов в повторяющиеся числа для каждого из девяти низких используйте размеры фрагментов повторяющихся чисел эталонного штамма Af293. Из 3 826 образцов почвы, собранных в 53 местах в девяти странах, было выделено 1 473 штамма дрожжей. Наилучшая температура инкубации для каждой страны определялась на основе ее среднегодовой температуры.
В анализе разрежения для каждой страны индекс разнообразия Шеннона использовался в качестве меры разнообразия почвенных дрожжей. Полученные кривые разрежения приблизились к асимптоте насыщения, что указывает на то, что дополнительный отбор проб вряд ли дал бы больше разнообразия дрожжей. Мицелиальный рост на пластинах сформировал зеленую качающуюся морфологию, типичную для Aspergillus fumigatus.
Другие термотолерантные виды грибов могут присутствовать в том же образце почвы и выращивать Aspergillus fumigatus на той же пластине или самостоятельно. Aspergillus fumigatus conidiophore structure, рассмотренная и идентифицированная с помощью световой микроскопии, показала, что конидиофоры имеют шар на палочке морфологию, а конидиофоры унисериатные, где фиалиды, прикрепленные к цепочкам конидий, прикреплены непосредственно к сферическому пузырьку. Хроматограмма, генерируемая бизериатом, выявила три канала, визуализирующие длины фрагментов Aspergillus fumigatus dinucleotide, тринуклеотида и тетрануклеотида коротких тандемных локусов повторов.
Высококачественная минимальная охватывающая сеть может быть сгенерирована с помощью скрипта R plot_poppr_msn или imsn. Дискриминационный анализ основных компонентов является еще одним методом визуализации генетических связей между штаммами. Добавление беномила и хлорамфеникола в питательные среды предотвращает рост плесени и бактерий соответственно и способствует отбору дрожжей.
Хлорамфеникол также уменьшает ферментацию в средах, уменьшая накопление газа в инкубационных трубках. Проведение метагеномики на образцах почвы позволит получить дополнительную информацию о культурном разнообразии. Восприимчивое тестирование штаммов A.fumigatus позволит выявить наличие генотипов резистентности.
Этот протокол может быть применен к другим дрожжевым и плесневым системам с небольшими изменениями. Это способствовало исследованию культурного разнообразия почвенных дрожжей и его предикторов в глобальном масштабе.
