Мы разработали методологию картирования FRET, которая позволяет идентифицировать и характеризовать сайты связывания лигандов, ориентацию субъединиц, конформационные изменения, связанные с связыванием лигандов, и динамические движения белков. Преимущество этого метода заключается в том, что он может быть выполнен в растворе, и молекулы могут свободно перемещаться. Расстояния, измеренные с помощью этого метода, подходят для биологических систем.
FRET широко применим ко многим системам. Картирование улучшает мониторинг структурных и динамических изменений в любой биомолекулярной системе и особенно эффективно, если существует трехмерная структурная информация. После очистки белка самой сложной частью является маркировка с высокой эффективностью и удаление свободного красителя.
Для экспериментов помогает иметь как можно меньше свободного красителя. Для начала выбирайте места маркировки в пределах от 25 до 75 ангстрем от места карательного связывания и в относительно статических областях белка. Расстояние будет определять конкретную пару красителей FRET, которая будет использоваться.
Найдите сайты маркировки в белковых областях, которые относительно отличаются друг от друга. Таким образом, сайты описывают вершины треугольника, с карательным местом связывания, расположенным в центре. Для измерения значений R0, в зависимости от желаемого размера и объема кюветы, подготовьте два образца белка в одинаковой концентрации общего белка.
Один с белком, помеченным только донорским красителем, и один с белком, помеченным только акцепторным красителем. Включите флуорометр и откройте программу спектрального сбора и анализа в программном обеспечении FluorEssence, если используется спектрофлуорометр. Нажмите на красный M, чтобы подключить компьютер к прибору, и выберите Спектры излучения.
Введите параметры сканирования с помощью пункта меню сбора эксперимента, такие как длина волны возбуждения, диапазон сканирования излучения, температура и изменение положения образца. Нажмите на RTC и оптимизированные настройки прибора, как описано в рукописи, путем мониторинга флуоресцентного излучения на пике с использованием длины волны возбуждения, установленной на максимуме поглощения красителя. Поместите помеченный донором образец белка в держатель образца и нажмите кнопку run, чтобы создать сканирование излучения белка, помеченного только донорским красителем, путем возбуждения образца на максимуме поглощения красителя и сканирования на пике излучения.
Установите базовый уровень для сканирования, расширив сканирование на 25-50 нанометров после конца пика. Измерьте квантовый выход донорского только белка, выполнив измерения абсорбции и флуоресценции на образцах различных концентраций, как описано в тексте рукописи. Приготовьте образцы только донорского белка, только акцепторного белка и донор-акцепторные образцы белка в той же концентрации.
Получите донор только сканирование для генерации спектров флуоресцентного излучения. Возбуждайте раствор на максимуме поглощения донорского красителя и сканируйте пики выбросов донора и акцептора. Либо замените образец на белок только акцептор, либо измените образец на кювету, содержащую только акцепторный белок.
Получите эмиссионное сканирование белка, помеченного только акцепторным красителем. Возбуждайте образец на длине волны возбуждения донора. Замените образец на образец донорско-акцепторного белка или измените образец, измените свое положение на кювету, содержащую донор-акцептор, меченый белком.
Получите эмиссионное сканирование образца донорно-акцепторного белка с использованием тех же настроек. Для всех спектров исправьте фоновую флуоресценцию, вычитая количество фона, измеренное в конце сканирования. Используйте 3D-графическую программу просмотра, такую как PyMOL, чтобы сопоставить расстояния со структурой, непосредственно вводя команды из скрипта в командное окно с соответствующей информацией о расстоянии.
Создайте оболочку для каждого измеренного расстояния и связанной с ним ошибки. Нанесите положение на карту через пересечение различных оболочек. Сайт связывания сигнального пептида был нанесен на карту с использованием трех различных мест на SecA и SecYEG и четырех различных мест на сигнальном пептиде.
Эксперименты FRET между различными областями пре-белка и тремя различными местами на белках SecA и SecYEG отображают участок и ориентацию предварительного связывания с белками. Место карательного связывания сигнального пептида ранее было идентифицировано как палец с двумя спирали, а хвост SecA C-терминал предполагал ориентацию, параллельную пальцу с двумя спиралями. Получены спектры устойчивого состояния FRET между SecA37 и PhoA2 и PhoA22.
Снижение донорской интенсивности указывает на то, что больше энергии передается от PhoA22. Относительно сайта PhoA2, который расположен дальше от SecA37. Спектры флуоресцентного распада с временным разрешением показали, что донор-акцепторный комплекс имеет более короткий однородный распад, согласующийся с передачей энергии, связанной с одним расстоянием.
Дистанционные оболочки FRET, построенные между остатком SecA PhoA2 и триангулированными участками, продемонстрировали, что каждая оболочка пересекается с пальцем с двумя спирали, предполагаемым местом связывания, которое показано зеленым цветом. Пересеченная площадь меньше, чем каждая оболочка FRET, и включает в себя большой вклад от спирального каркаса. Расстояние между оболочками FRET, определяемое между остатком PhoA2 и мечеными участками, описывает меньшую площадь, расположенную ближе к кончику двухспирального пальца и устью канала SecYEG.
Эта пересекающаяся область расположена на противоположном конце пальца с двумя спирали от PhoA2. Важные вещи, которые следует учитывать, включают правильный выбор сайтов маркировки для триангуляции интересующей области, для измерения квантовых выходов для каждого участка и удаления всего свободного красителя. Этот метод согласуется со структурной информацией, полученной с помощью таких методов, как ЯМР или рентгеновская кристаллография.
Когда результаты FRET помещаются в структурный контекст, это может улучшить существующую информацию.
