Одномолекулярный FRET может захватывать динамику, происходящую на нанометровых расстояниях, что является правильным масштабом для процесса биосинтеза рибосомного белка. Рибосома работает, координируя множество факторов и компонентов аллостерически, что по своей сути неоднородно. Одномолекулярный метод может отслеживать каждую рибосому, не ограничиваясь этим неоднородным средним эффектом.
Этот метод покажет, как антибиотики ингибируют функцию рибосом для разработки новых лекарств для лекарственно-устойчивых бактериальных инфекций. Начните с приготовления PRE, смешивая смесь EFTU, NOG и PAG в соотношении один к двум при 37 градусах Цельсия в течение двух минут. После инкубации очистите PRE с помощью ультрацентрифугирования 1,1 молярной сахарозной подушки в течение ночи в 100 000 раз G. Приготовьте POST, смешивая смесь EFTU, WG и PHE в соотношении один к двум при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут.
После инкубации очистите POST с помощью ультрацентрифугирования 1,1 молярной сахарозной подушки в течение ночи в 100 000 раз G. Очистите стеклянные слайды микроскопа, содержащие шесть пар отверстий диаметром один миллиметр и стеклянные крышки микроскопа с цифрой 1,5. Выпекайте чистые горки и обтекаемые крышки при 300 градусах Цельсия в течение трех часов, затем покрывайте крышку аминосалином. В чистом ламинарной вытяжке положите одну крышку на поверхность.
Осторожно опустите 60 микролитров раствора ПЭГ на верхний край, затем положите еще один покровный лист поверх него, позволяя капиллярному эффекту распределить раствор между ними, гарантируя, что не образуются пузырьки. Повторите эти шаги еще для двух пар обложек. Храните эти крышки в пустой коробке с наконечниками, наполненной водой, и высиживайте их в течение трех часов в темноте.
Через три часа отделите крышки, промойте водой в трех последовательных тиглях и продувку сухой струей азота. Протяните острые кончики пипетки через отверстия на стеклянных слайдах, пока они плотно не прилегают. Соскоблите острые концы до тех пор, пока они не будут полностью плоскими со стеклянной поверхностью, затем отрежьте двустороннюю ленту с рисунком канала на ней.
Наклеивайтесь на стеклянные горки с плоской стороны. Наклейте крышку с покрытием на двустороннюю ленту и нажмите на нее, чтобы сделать плотное уплотнение камеры для образцов, убедившись, что сторона с покрытием обращена внутрь. Включите компьютер и переключатель микроскопа.
Запустите интерфейс управления лазером и включите лазер. Нажмите кнопку включения на блоке управления лазером, чтобы разогреть лазер. Включите камеры, затем запустите программное обеспечение, связанное с микроскопом.
Отключите верхний затвор и включите лампу. Подготовьте TAM10 с буфером анимации, добавив 10 микролитров 5%Tween-20 в один миллилитр буфера TAM10. Готовят дезокси-раствор, взвешивая три миллиграмма глюкозооксидазы в небольшой микроцентрифужной пробирке и добавляют в нее 45 микролитров каталазы.
Осторожно вихрь трубку, чтобы растворить твердое вещество. Вращаем в 20 000 раз G в микроцентрифуге в течение одной минуты и принимаем супернатант. Готовят 30%-ный раствор глюкозы, 200 миллимолярный раствор Тролокса и 0,5 миллиграмма на миллилитр раствора стрептавидина, следуя инструкциям в текстовой рукописи.
Добавьте одну каплю масла для визуализации в цель газона. Поместите пробные камеры на объектив. Заполните камеру 10 микролитрами раствора стрептавидина и подождите одну минуту.
Промывайте камеру 30 микролитрами TAM10 с буфером Tween, собирая проточной раствор с помощью сложенной фильтровальной бумаги. Подождите одну минуту после стирки. Разбавляют рибосомные комплексы PRE или POST до 10-15 наномолярных концентраций с помощью TAM10 с буфером анимации.
Загрузите 20 микролитров образца рибосомы в канал и подождите две минуты. Сделайте буфер визуализации, используя 50 микролитров буфера TAM10 и по 0,5 микролитра дезоксиглюкозы и раствора Trolox. Хорошо перемешайте.
Промывайте камеру 30 миллилитрами буфера визуализации. Установите камеру для получения изображений. Нажмите на верхний затвор и выключите лампу.
Запустите сбор камеры и разложите изображения по трем окнам, представляющим две отдельные камеры и наложение. В меню приобретения выберите таймлапс захвата, а затем автоматически нажмите на захват. Установите соответствующее имя файла, путь к файлу и количество циклов и нажмите «Запустить сейчас».
Закройте всплывающее окно после завершения получения изображения, а затем откройте полученный ND-файл. Нажмите на ROI, простой редактор ROI и выберите круг опций. Выберите РЕНТАБЕЛЬНОСТЬ инвестиций на изображении и нажмите «Готово», когда оно будет завершено.
Нажмите на измерение, измерение времени, чтобы показать данные либо в виде графика, либо в виде электронной таблицы. Откройте вкладку экспорта, чтобы задать параметры экспорта, затем нажмите «Экспорт», чтобы сохранить интенсивность. Наконец, откройте файл, который был экспортирован с помощью подходящего приложения.
Расстояние от остатка маркировки L27 до ТРНК A-сайта или P-сайта составляет 61 или 52 ангстрем соответственно, что соответствует эффективности FRET 0,47 и 0,65. Интенсивность цветения из донорского и акцепторного каналов была извлечена и построена в виде таймлапсов. После донорского отбеливания оба следа приблизились к исходному уровню, потому что возбуждение не могло произойти непосредственно на акцепторе.
После акцепторного отбеливания интенсивность донора увеличилась, потому что меньшее количество реакционных путей рассеивало энергию возбуждения. Отдельные рибосомы демонстрировали различные флуктуации из-за колеблющегося движения тРНК, что вызывало флуктуации расстояния до L27. Другие методы, такие как анализ пуромицина, анализ, анализ отпечатков на носке и масс-спецификация, дополняют метод ФРЕТ с одной молекулой и раскрывают больше деталей о синтезе белка.
Одномолекулярный FRET имеет широкое применение, потому что многие биологические процессы происходят в нанометровом диапазоне и в миллисекундных временных масштабах. Помечая правильные красители в правильных положениях, можно выявить многие другие динамики.
