Целью данной процедуры является анализ растительных экстрактов методом чистого сдвигового ЯМР. Следующий протокол включает в себя ключевые аспекты подготовки образцов из различных растительных матриц, листьев ванили, клубней картофеля и плодов капского крыжовника, а также подробную пошаговую процедуру ЯМР для регистрации оптимальных спектров чистой психики сдвига и психики SAPPHIRE. Метаболическое профилирование с помощью протонного ЯМР — это искусство анализа сигнала за сигналом в мириадах сигналов в спектрах ЯМР сложной биологической смеси с целью идентификации каждого метаболита в этой смеси.
Цель состоит в том, чтобы изобразить биомаркеры, которые могут быть связаны с хемотаксономией, фенотипированием, органолептическими свойствами, наименованием происхождения, метаболическими реакциями и другими важными областями науки о растениях. Протонный ЯМР обычно используется в метаболическом профилировании. Однако большое количество сигналов с кратностями расширения, ограниченных узким спектральным диапазоном произведения, приводит к обширному перекрытию, что затрудняет анализ и интерпретацию спектра.
Как правило, одиночный резонанс имеет ширину от одного до пяти герц. Тем не менее, сильно связанный сигнал может распространяться с частотой более 25-50 Гц, что увеличивает вероятность перекрытия сигнала. Чтобы преодолеть это ограничение, мы применяем современный метод ЯМР с чистым сдвигом для объявления спектрального разрешения, как показано здесь, в трех различных сценариях работы завода.
Подготовка образцов, приготовление экстракта растения может быть выполнена разными способами и процедура будет зависеть от матрицы. Плоды капского крыжовника сначала гомогенизировали в сок. Листья ванили были использованы в неповрежденном виде, а картофель был нарезан защищенным от окисления ломтиками.
Во всех случаях материал лиофилизировался, измельчался, а затем извлекался. Для добычи плодов капского крыжовника и картофеля для экстракции использовалась вода с помощью ультразвуковой обработки. Надосадочная жидкость восстанавливалась центрифугированием, любая жидкость высыхалась лиофилизацией или скоростным вакуумом.
Сухой экстракт ресуспендировали в оксалатном буфере, выпаривали до сухости и повторно растворяли в D2O, содержащем TMSP. В случае ванили экстракцию проводили напрямую с использованием дейтерированного фосфатного буфера, содержащего TMSP и дейтерированный метанол. Надосадочная жидкость также была восстановлена путем центрифугирования.
Все образцы фильтровали через шприцевой фильтр из ПТФЭ, а ЯМР-пробирки заполняли 0,6 миллилитрами отфильтрованного раствора. Ключевым моментом является подготовка образцов в рамках метаболомики ЯМР. Поскольку процедура будет повторяться сотни раз, она должна быть подготовлена точно таким же образом, чтобы гарантировать, что наблюдаемое отклонение связано не с подготовкой образца, а с реальными различиями между изучаемыми растениями.
Чистый сдвиг ЯМР. Спектр ЯМР получается после преобразования Фурье сигнала FID. Сигнал FID может быть разложен на две составляющие: модуляцию химического сдвига и модуляцию связи J, отвечающую за схему расщепления связи J.
Модуляция связи J может быть перефокусирована с помощью элемента перефокусировки связи J, который избирательно инвертирует пассивные спины, в то время как активные спины остаются неизменными. После двух равных задержек химическая J-связь полностью перефокусируется. Элемент психики, основанный на эксперименте anti-z-COSY, является одним из самых надежных и чувствительных элементов широкополосной перефокусировки, свойства, которые делают его пригодным для метаболомики ЯМР.
Эксперименты с чистым сдвигом основаны на перефокусировке эволюции J-связи во время регистрации химического сдвига. Обычно это достигается за счет увеличения задержек для перемещения точки перефокусировки J-связи. Поскольку химический сдвиг развивается с более высокой частотой, чем J-связь, эксперимент с гомоядерной развязкой может быть записан в виде интерферограммы.
Получение интерферограммы, заключается в регистрации FID небольшими отрезками с точкой перефокусировки эволюции J-связи, всегда совпадающей с центром полученного участка. Разъединенный FID строится путем конкатенации каждого последующего блока. Настройка сбора данных ЯМР, перенос образцов на ЯМР-спектрометр.
Настройте и совместите головку зонда, зафиксируйте и закрепите образец. Откалибруйте жесткий импульс под углом 90 градусов. Запуск стандартного 1D протонного ЯМР-спектра.
Психический эксперимент. Выберите последовательность импульсов сброса психики 1D из библиотеки Bruker TopSpin. Установите ширину спектра равной пяти килогерц.
Задержка восстановления релаксации минимум до одной-двух секунд. Манекен сканирует до 16. Количество сканирований 64 или 128 и количество точек комплексных данных на блок (64 или 128) задают желаемое возбуждение угла поворота импульса ЛЧМ.
Хорошим компромиссом между чувствительностью и малыми артефактами обратной связи является установка постоянной от 61 до 20 градусов, 10 килогерц для полосы пропускания импульсов ЛЧМ. Установите длину жесткого импульса на ранее откалиброванный объем, а длину импульса по форме психики на 30 миллисекунд. Выберите Crp_psyche.
20 Форма пульса для элемента психики. Сила градиента импульсного поля, приложенного к элементу психики, обычно устанавливается в диапазоне от одного до 4% от максимальной силы градиента в зависимости от зонда. Выберите команду RECT.
1 для импульса градиентной формы. Установите количество блоков для восстановления чистого сдвига FID. Как правило, 16 или 32 блока с 64 или 128 комплексными точками в блоке обеспечивают достаточное цифровое разрешение, прогон спектра и обработку данных.
С помощью программы Брукера proc_reset AU, а затем преобразования Фурье. Мы рекомендуем трансформировать спектр с помощью нулевого наполнения и аподизации синусоидального колокола. Психика — это псевдо 2D эксперимент по интерферограмме.
Это программное обеспечение от артефактов периодического бокового диапазона, поступающих из небольшой эволюции J-связи во время захвата каждого блока, которые обычно варьируются от пяти до 20 миллисекунд при анализе чистого соединения, этими артефактами можно пренебречь, поскольку они обычно составляют менее 5% от родительского пика. Однако в сложных смесях артефакт бокового пролета некоторых метаболитов может быть таким же большим или большим, чем сигнал менее концентрированных метаболитов, что ставит под угрозу точность метаболического анализа. Эти артефакты могут быть эффективно удалены с помощью модификации эксперимента с психикой под названием SAPPHIRE psyche, разработанного в эксперименте SAPPHIRE Pyche от Morris Lab.
Чтобы получить развязанный спектр, последовательность импульсов получает небольшие участки перефокусировки FID в J-связи в середине каждого блока. Тем не менее, небольшая эволюция J-связи происходит во время каждого блока и порождает периодические артефакты боковой зоны. Эксперимент SAPPHIRE psyche представляет собой модификацию регулярной последовательности психе, в которой эти периодические артефакты удаляются путем систематической фазовой модуляции, достигаемой сдвигом точки перефокусировки J.
После добавления каждой фазовой модуляции остаточная эволюция J-связи сильно подавляется, что дает гораздо более чистый чистый спектр сдвига. Выберите последовательность импульсов SAPPHIRE psyche и задайте параметры последовательности импульсов. Этой последовательности нет в репертуаре Bruker, однако последовательность и программы обработки можно получить на веб-сайте Манчестерской методологической группы ЯМР.
Стандартные параметры установлены на следующие значения: спектральная ширина пять килогерц, задержка релаксации не менее одной-двух секунд. 16 фиктивных сканирований, восемь или 16 сканирований с шагом и D2, установленный на 14 миллисекунд. Этот параметр гарантирует, что релаксация T2 остается постоянной с каждым шагом модуляции J.
Установите желаемый импульс ЛЧМ, угол переворота, значение возбуждения и ширину полосы пропускания импульса. Установите длину жесткого импульса на ранее откалиброванное значение, а длину импульса формы психики на 30 миллисекунд. Выберите PSYCHE_Saltire_10kHz_30m форму пульса для элемента психики.
Установите силу градиента импульсного поля, приложенного во время действия элемента психики. Выберите RECT. 1 для формы градиента.
Установите количество приращений модуляции Sapphire J в F2, обычно восемь приращений обеспечивают превосходное подавление артефактов боковой полосы. Задайте спектральные окна F1 и F2, которые вычисляются из выбранного значения спектрального окна F3, с помощью следующих выражений. Чистая продолжительность блока сдвига, описываемая как одна над SW1, обычно устанавливается в диапазоне от 20 до 40 миллисекунд.
Задайте количество чистых блоков сдвига. Поскольку SAPPHIRE psyche необходимо компенсировать развязывающую фазовую модуляцию первого блока, необходимо добавить еще один блок. Как правило, 17 или 33 блока дают достаточное цифровое разрешение.
Обрабатываем данные, выполняем в pm_pshift и pm_fidadd программах AU с последующим преобразованием Фурье, рекомендуем преобразовать спектр с помощью нулевого заполнения и назначить аподизацию колокола. Результаты: эксперименты SAPPHIRE psyche увеличивают разрешение спектров за счет коллапса связанных резонансов в красивые острые синглеты, как это было показано на трех различных растительных матрицах. Например, листья ванили, плоды перуанского физалиса и клубни картофеля с кратностью комплекса SAPPHIRE Psyche, высокосвязанные водороды гомолимонной кислоты, которые генерируют почти непрерывные сигналы, распространяющиеся через 40 Гц, распадаются на три острых синглета.
Уменьшение скопления людей, которое может маскировать другие сигналы в этом районе. Полученное разрешение также помогло четко распутать сильно перекрывающуюся область между 2,6 и 2,8 ppm, в которой гомолимонная кислота является лактоном, и возникают резонансы яблочной кислоты. Ключевые биомаркеры ванили, например, сигналы WHO перекрываются с сигналами глюкозидов в обычном протонном ЯМР, были лучше идентифицированы в спектрах SAPPHIRE благодаря этому выдающемуся выигрышу в разрешении. Выводы.
Pure Shift является отличным новым инструментом для метаболомики растений. Это значительно увеличило разрешение спектра и, следовательно, позволило упростить идентификацию метаболитов, более точный корреляционный метрический анализ и лучшую интерпретацию многомерного анализа. После просмотра этого видео у вас будет хорошее понимание того, как готовить различные плановые экстракты для ЯМР-анализа и как регистрировать оптимальный чистый сдвиг психики и САПФИРОВОГО спектра психики.
