Ионная мобильность-масс-спектрометрия, или IM-MS, идентифицируют различные ионы продуктов из рН-зависимой редокса и метилобязательной реакции пептидов. При молекулярном моделировании их третичной структуры можно определить корреляцию металла. IM-MS может решить каждый из ионов продукта и определить их молекулярный состав путем одновременно измерять их время масс-к-заряда и прибытия и relating to их stoichiometry, положение протонации, и конформациальная структура.
Разработка классов металлических хелатирующих пептидов поможет привести к терапевтическим заболеваниям, связанным с дисбалансом ионов металла, таким как болезнь Менкеса и Уилсона, рак и болезнь Альцгеймера. Для начала тщательно очистите входные трубки ESI и капилляр иглы примерно с 500 микролитров 0,1 молярной ледниковой уксусной кислоты, 0,1 гидроксида молярного аммония и, наконец, деионизированной воды. Используйте родные условия ESI-IM-MS, описанные в текстовом протоколе, для сбора отрицательных и положительных ионных спектров IM-MS 10 ppm поли-DL-аланина решения в течение 10 минут каждый.
Пипетка 200.0 микролитров 0,125 миллимолярный альтернативный метанобактин, или амб раствор, в 1,7 миллилитров флакона. Разбавить 500 микролитров деионизированной воды и тщательно перемешать раствор. Отрегулируйте рН образца до 3,0, добавив 50 микролитров раствора 1,0 молярной уксусной кислоты.
Добавьте 200,0 микролитров иона металла 0,125 миллимолара в скорректированный рН образец. Затем добавьте деионизированную воду, чтобы получить окончательный объем в 1,00 миллилитров образца. Тщательно перемешайте и дайте образцу равноденствие в течение 10 минут при комнатной температуре.
Используя тупой шприц носа, возьмите 500 микролитров образца и соберите отрицательные и положительные ионные спектры ESI-IM-MS в течение пяти минут каждый. Используйте оставшиеся 500 микролитров образца для записи его окончательного рН с помощью откалиброванного микро-электрода рН. Повторите эти шаги, за исключением корректировки рН до рН четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или 10, добавив новые объемы уксусной кислоты или гидроксида аммония решений.
Соберите отрицательные и положительные ионные спектры ESI-IM-MS полученных решений в течение 10 минут каждый. Из спектра IM-MS определите, какие заряженные виды альтернативного метанобактина присутствуют, сопоставляя их с их теоретическими изотопами массы к зарядке. Для этого откройте MassLynx и нажмите на хроматограмму, чтобы открыть окно Хроматограммы.
Перейдите в меню File и Откройте, чтобы найти и открыть файл данных IM-MS. Извлекайте спектр IM-MS, нажимая правой кнопкой мыши, перетаскивая хроматограмму и выпуская. Откроется окно спектра, показывающее спектр IM-MS.
В окне спектра нажмите на инструменты и изотопную модель. В окне моделирования Isotope введите молекулярную формулу вида амб, проверьте заряженную ионовую коробку Show и введите состояние заряда. Нажмите OK. Повторите этот процесс, чтобы идентифицировать все виды в спектре IM-MS и зафиксировать их диапазон изотопов массы до заряда.
Для каждого вида амб, отделить любые случайные массы к зарядке видов и извлечь их распределения времени прибытия, или ATDs, используя их массы к зарядке изотопов моделей для их идентификации. Откройте DriftScope и нажмите на файл и откройте, чтобы найти и открыть файл данных IM-MS. Используйте мышь и левым щелчком мыши, чтобы увеличить масштаб массы до зарядки изотопного узора вида амб.
Используйте инструмент выбора и левую кнопку мыши, чтобы выбрать изотопный шаблон. Нажмите кнопку Приемлемого текущего выбора. Чтобы отделить любые случайные виды массы к зарядке, используйте инструмент выбора и левую кнопку мыши, чтобы выбрать время ATD, приведенную в соответствие с изотопным рисунком вида амб.
Нажмите кнопку Приемлемого текущего выбора. Для экспорта ATD, перейдите на файл, экспорт в MassLynx. Затем выберите Сохранить время дрейфа и сохранить файл в соответствующую папку.
В окне Chromatogram MassLynx откройте сохраненный экспортируемый файл. Нажмите на process, Интегрируйте из меню, проверьте поле ApexTrack Peak Integration и нажмите OK. Запись центроида и интегрированной области ATD. После повторения этого процесса для всех сохраненных файлов данных amb и poly-DL-alanine IM-MS, используйте интегрированный ATD для всех извлеченных видов amb или положительных или отрицательных ионов на каждом пункте титрования для того чтобы нормализовать к относительной шкале процента.
Для этого введите идентичности вида амб и их интегрированного ATD при каждом рН в электронную таблицу. Для каждого рН используйте сумму интегрированных ПДД для нормализации отдельных amb species'ATD в процентном соотношении. Участок процент интенсивности каждого вида амб по сравнению с рН, чтобы показать, как популяция каждого вида варьируется в зависимости от функции рН.
Используя электронную таблицу, преобразуете поперечные сечения поли-DL-аланина отрицательные и положительные ионы, измеренные в буферном газе гелия, в исправленные поперечные сечения столкновения. Затем преобразуем среднее время прибытия поли-DL-аланин-калибрантов и амб видов в дрейф раз. Подключите поли-DL-аланин calibrants'drift раз по сравнению с их исправлены столкновения поперечных сечений.
Затем, используя наименее квадратную регрессию, определите значения A prime и B, где прайм является коррекцией параметров температуры, давления и электрического поля, а B компенсирует нелинейный эффект устройства чата. Используя эти значения A prime и B с значением времени дрейфа центроидов, определите их исправленные поперечные сечения столкновения и поперечные сечения столкновения. Этот метод обеспечивает столкновение поперечных сечений для пептидных видов с оценками абсолютных ошибок около 2%Использование Gaussian с GaussView, и Уровень теории B3LYP LanL2D, найти геометрии оптимизированных конформеров для всех возможных типов координации наблюдаемых масс-к-заряда амб видов.
Теория теории B3LYP LanL2D состоит из трех гибридных функциональных элементов периметра Becke, набора основ Даннинга и потенциалов электронного ядра. Извлекайте термохимический анализ каждого из оптимизированных конформеров из гауссийского выходного файла и вычисляйте их теоретические поперечные сечения столкновений с помощью ионно-масштабного метода Леннарда-Джонса из программы Sigma. От самых низких свободных конформеров энергии, определить, какой конформист экспонатов Леннард-Джонс столкновения поперечного сечения, что согласен с IM-MS измеряется столкновения поперечного сечения.
Этот процесс определяет третичную структуру и тип координации для конформистов, наблюдаемых в эксперименте. Молекулярное моделирование требует сравнения свободной энергии и столкновения поперечных сечений конформеров с различными металлическими хелатирующими участками, cis и транс-пептидными связями, соляными мостами, водородными связями и пи-катионом взаимодействий. Исследование альтернативного метанобактина, проведенное IM-MS, показало, что он хелатировал ионы меди и цинка в зависимости от рН образом, но с помощью различных механизмов реакции и координационных участков.
Связывание цинка (II) наблюдалось при рН более шести, в основном образуя единый отрицательно заряженный комплекс, указывающий на то, что цинк (II) был тетрагедрально скоординирован двумя имидазолами и двумя тиолатами. Медь (II) связывание сопровождалось тиолами, образующими дисульфидный мост. При рН более шести образовался единый отрицательно заряженный медный (II) комплекс, указывающий на то, что имидазол и два депротонированных амидных азота координировали медь (II)Однако, ниже рН шесть, добавив медь (II), также образовался единый положительно заряженный медный (I)комплекс, а также единый положительно заряженный медный (II)комплекс выше рН шесть.
Im-MS исследования амб два и амб четыре также показывают, что медные реакции дали продукты, которые отличаются по количеству меж- или внутримолекулярных дисульфидных мостов, количество меди (I) или меди (II) ионов, а также количество сайтов депротонации, которые изменились в зависимости от функции рН. Результат IM-MS с молекулярным моделированием показал, что альтернативные метанобактины могут координировать до трех медных (I) ионов через тиолат, имидазолы и карбоксилатные группы. Инструментальные настройки IM-MS должны быть тщательно подобраны для сохранения пептидов'stoichiometry, распределения заряда, и конформации структур, как описано в тексте.
Сочетание более широкого диапазона размеров, которые будут влиять на координацию металла, таких как тирозин на аспарагиновой кислоты позволит лучше понять взаимосвязь между структурой и функцией. IM-MS с молекулярным моделированием стали альтернативными методами ускорения кристаллографии и спектроскопии ЯМР для определения конформативных структур белков, ДНК, липидов и их комплексов.
