РНКи стали эффективным методом идентификации функции генов у нематод и предложены как новый способ эффективного контроля патогенных нематод. РНКи замачивает нематод в дцРНК может хватить для процедуры. Для начала соберите нематод методом воронки Бэрманна.
Для этого поместите зажатую резиновую трубку ниже воронки и поместите два слоя фильтровальной бумаги в горловину воронки. Перенесите грибковые культуры Botrytis cinerea в воронку и добавьте воду для погружения грибкового мата. Когда нематоды собраны, добавьте 500 микролитров экстракционного реагента и 100 микролитров магнитных шариков в двухмиллилитровую центрифужную трубку.
Аспирировать 20 микролитров нематод и измельчать образцы при 9 000 х г в течение 30 секунд. Инкубировать в течение пяти минут и центрифугировать при 12 000 х г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите супернатант в свежую центрифужную трубку.
Добавьте 100 микролитров хлороформа и перемешайте, перевернув трубку несколько раз. Инкубировать в течение трех минут, а затем центрифугировать при 12 000 х г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Опять же, перенесите супернатант в свежую трубку центрифуги.
Добавьте 250 микролитров изопропилового спирта и энергично вихрь. Центрифуга при 12 000 х г в течение 10 минут и вихрь. Откажитесь от супернатанта и добавьте 500 микролитров 75% этанола для промывки РНК.
Вихрь образца с последующим центрифугированием при 12 000 х г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Высушите гранулу РНК на воздухе в течение пяти минут и повторно суспендируйте ее в 30 микролитрах рваной воды. Рассчитайте концентрацию РНК, используя эту формулу, и рассчитайте отношение A260 к A280.
Затем используйте пару праймеров для усиления частичной кодирующей последовательности гена BX ppm-1 из B.xylophilus. Затем клонируют последовательность гена ppm-1 в вектор pGEM-T Easy, содержащий промотор T7. Восстановите 894 пары оснований длинного фрагмента гена ppm-1, используя клонированную плазмиду в качестве шаблона для ПЦР.
Затем используйте набор транскрипции in vitro для синтеза дцРНК. Проанализируйте качество дцРНК с помощью спектрофотометра и визуализируйте продукты на 1% агарозном геле. Добавьте четыре микролитра 5-кратного замачивающего буфера и увеличьте объем до 20 микролитров двойной дистиллированной водой, чтобы получить конечную концентрацию РНК 0,8 микрограмма на миллилитр.
Затем поместите нематод в блюдо на 30 минут и подождите, пока яйца прилипнут ко дну. Осторожно удалите воду и нематод, не нарушая яйца, пока в блюде не останутся только яйца. Высиживайте собранные яйца в темноте при 25 градусах Цельсия в течение 24 часов, чтобы получить личинки J2.
Соберите личинок в трубку и трижды промойте их двойной дистиллированной водой. Затем перенесите личинок в трубку, содержащую раствор дцРНК. К этому добавляют раствор резорцина, чтобы получился 1% раствор.
Поместите личинок на встряхивающий стол, чтобы обеспечить достаточное поглощение дцРНК в личинках. Для контроля замочите такое же количество нематод в буфере замачивания без зонда dsRNA или с помощью зонда gFP dsRNA. Выполните qPCR, используя гены actB и tbb-2 в качестве внутренних ссылок для оценки изменений уровня экспрессии генов.
Используйте метод дельта-дельта Ct для оценки относительного уровня экспрессии генов по кривой растворения и значению Ct. После RNAi культивируйте личинок J2 до зрелого возраста на газонах Botrytis cinerea на пластинах PDA. Соберите взрослых особей с помощью метода воронки Баермана, как показано в первом разделе.
Получите изображения взрослых нематод под микроскопом и используйте программное обеспечение ImageJ для измерения длины тела 50 самцов и 50 самок нематод. Анализируйте данные, вычисляя среднее и стандартное отклонение для каждой выборки. Примените тест Student's t для сравнения средних образцов из разных групп.
Относительный анализ экспрессии генов после RNAi показал, что дцРНК ppm-1 может эффективно ингибировать экспрессию ppm-1 одного гена B.Xylophilus. В то время как экзогенная ГФП дцРНК не оказывала влияния на экспрессию ppm-1. После РНКи размер взрослых особей заметно уменьшился, несмотря на достижение половой зрелости, что привело к небольшому размеру тела мутантного фенотипа.
Средняя длина тела мутантных самок и самцов составила 544 и 526 микрометров по сравнению с 971 и 912 микрометрами для контрольной группы Самое главное – перевести нематод в двухцепочечный раствор РНК и добавить еще один реагент для стимуляции нематод к питанию. Этот метод подходит для крупномасштабного генного скрининга и обычно используется в исследованиях клеток. Изучение функции гена B.Xylophilus этим методом имеет руководящее значение для биологического контроля B.Xylophilus.
