Это видео протокол для электропорации опосредованного метода РНК-интерференции в Одоната. Стрекозы и damselflies, члены ордена Одоната, являются одними из самых предков насекомых. Взрослый Odonata показать замечательное разнообразие в цветах тела и моделей, и многие экологические и поведенческие исследования были проведены.
Тем не менее, молекулярно-генетических исследований на Odonata не хватает, потому что генный функциональный анализ очень трудно. Например, обычный метод РНК не эффективен у видов Одоната. Недавно мы создали метод RNM в сочетании с электропорацией in vivo.
Здесь мы предоставляем видео-протокол для электропорации опосредованного РНК как в стрекозах, так и в плотинах. Как наш представитель damselflies видов мы используем синехвостый damselfly. Ишнура сенегаленсис.
Это один из самых распространенных видов damselfly и часто встречается в солнечных прудах в Японии. Во-первых, мы показываем протокол РНК, направленный на брюшную полость плотины, Ischnura senegalensis. После ледяной анестезии при этом две булавки по обе стороны проторакса и зафиксировать личинку на фиксированной подсвеч.
Потяните и растянуть меж сегментальную мембрану между седьмым и восьмым сегментом брюшной полости с помощью типсов. Держите меж сегментальную мембрану растянутой вручную. Вставьте кончик подготовленного капилляра в растянутую межсекментальную мембрану.
Ввилите 1 микролитер раствора siRNA или dsRNA. Нанесите две капли ультразвукового геля на поверхность личинки с помощью типсов. Поместите электроды на ультразвуковой гель, с положительным электродом на стороне инъекции.
Создайте 10 раз электропорации импульсов с помощью электропоратора. Протрите оставшийся гель на поверхности бумажной башней. Удалите булавки насекомых и держать обработанные личинки на мокром бумажном полотенце в течение примерно одного дня для восстановления.
Далее мы покажем протокол РНК, нацеленный на грудную клетку плотины, Ischnura senegalensis. После ледяной анестезии прикрепите две булавки по обе стороны проторакса и закрепите личинку на фиксированной подсвечок. Потяните и растянуть межсекментальную мембрану между протораксом и синтораксом с помощью руки.
Вставьте кончик подготовленного капилляра в растянутую межсекментальную мембрану. Введать один микролитер раствора siRNA или dsRNA. Нанесите две капли ультразвукового геля на поверхность личинки с помощью типсов.
Поместите электроды на ультразвуковой гель, с положительным электродом на стороне инъекции. Создайте 10 раз электропорации импульсов с помощью электропролятора. Протрите оставшийся гель на поверхности бумажной башней.
Удалите булавки насекомых и держать обработанные личинки на мокром бумажном полотенце в течение примерно одного дня для восстановления. В качестве репрезентативного вида стрекоз мы используем стрекозу Pied skimmer. Псевдотемис зоната.
Это один из наиболее распространенных видов стрекоз и часто встречается в тенистых прудах в Японии. Наконец, мы показываем протокол RNI, направленный на живот стрекозы, Pseudothemis zonata. Растянуть межсекментальную мембрану между четвертым и пятым сегментом брюшной полости.
Сделайте небольшое отверстие с тонкой иглой между четвертым и пятым сегментом брюшной полости. Вставьте кончик подготовленного капилляра в подготовленное отверстие. Введать один микролитер раствора siRNA или dsRNA.
Зафиксите личинку на фиксированном стенде с помощью булавок. Нанесите две капли ультразвукового геля на поверхность личинки с помощью типсов. Поместите электроды на ультразвуковой гель с положительным электродом на стороне инъекции.
Создайте 10 раз электропорации импульсов с помощью электропоратора. Протрите оставшийся гель на поверхности бумажной башней. Удалите булавки насекомых и держать обработанные личинки на мокром бумажном полотенце в течение примерно одного дня для восстановления.
Здесь мы выбрали ген синтеза меланина MCO2 в качестве целевого гена, и EGFP или бла в качестве отрицательной цели контроля. MCO2 имеет важное значение для формирования черного цвета у различных насекомых. Сначала мы показываем результаты в брюшной полости Ischnura senegalensis.
Белые наконечники стрел указывают на области подавленной черной пигментации, где положительный электрод был помещен на электропорации. Инкубация пигментации наблюдалась как при лечении siRNA, так и при лечении dsRNA. Размер и расположение фенотипа RNI значительно различались среди отдельных лиц.
Без электропорации не наблюдалось фенотипов RNI, что указывает на то, что электропорация необходима для RNI у этого вида. Далее мы покажем результаты в грудной клетке Ischnura senegalensis. Аналогичным образом ингибирование черной пигментации наблюдалось по всему региону, где положительный электрод был помещен на электропорации.
Наконец, мы показываем результаты в брюшной полости Pseudothemis zonata. Как и ожидалось, фенотип RNI был обнаружен по всему региону, где положительный электрод был помещен на электропорации. Мы подтверждаем, что метод РНК, опосредованное электропророцией, очень полезен в Одонате.
Он может вызвать локальное подавление генов почти на 100% эффективность. По крайней мере, при эпидермисе, когда мы выбираем соответствующие этапы развития. Этот метод имеет несколько по методу CRISPR/Cas9.
Например, область, где появляются фенотипы РНК, может контролироваться положением положительного электрода при электрпорации, а фенотипы РНК можно легко сравнить с генотипами управления бок о бок у одного и того же человека. Кроме того, этот метод не требует микроинъекции в крошечные яйца. Таким образом, гораздо проще и быстрее наблюдать фенотип быстрее, чем метод CRISPR/Cas9.
Кроме того, этот метод может быть применен к насекомым, чьи недавно обложенные яйца трудно собрать. Например, самки Псевдотемис зонаты откладывают яйца во время полета. Так что очень трудно собрать их недавно заложенные яйца.
Мы ожидаем, что этот протокол может быть в целом применим к не моделей организмов, когда обычные RNI не работает эффективно.
