Протокол предоставляет простой способ изучения американских тараканов. Распространенный санитарный вредитель и полезное насекомое для традиционной китайской медицины. Это поможет исследовать молекулярные механизмы множественной жизнедеятельности американских тараканов путем сбивания специфических генов.
Основным преимуществом этой технологии является то, что она может сбивать гены у американского таракана или других подобных насекомых, которые не подходят для редактирования генов. Эта технология может быть использована для изучения различных областей, таких как генетическая и эпигенетическая регуляция, процесс развития тканей, регенерация придатков, брачное поведение и другие интересные стороны американского таракана. Эта технология проста в эксплуатации и универсальна.
Мы рекомендуем поддерживать здоровье животных во время инъекционного лечения DSRA. Я считаю, что новички могут легко освоить эту технику после нескольких практических занятий. Для начала отделите вылупившихся нимф от оотеков четырехмиллиметровым ситом.
Выделите белый свежесолодовый P.americana со стеклянной трубкой. Поместите P.americana в новые контейнеры и дождитесь правильного этапа лечения. В реакционную систему добавляют 10 микролитров буфера T7 2X, 2 микролитра T7 Express Enzyme Mix и два микрограмма продукта ПЦР.
Наконец, составьте общий объем до 20 микролитров с помощью двойной дистиллированной воды. Аккуратно перемешать вверх ногами вручную и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут, затем 70 градусов Цельсия в течение 10 минут. Разбавить 4 мкг на микролитр раствора РНКазы А водой DEPC в соотношении 1 к 200.
Затем добавляют в систему 1 микролитр одной единицы на микролитр RQ1 RNase Free Dnase и 1 микролитр разбавленного раствора RNase A. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем добавляют 10% от общего объема ацетата натрия и три объема от общего объема изопропанола.
Аккуратно перемешать вверх ногами вручную, затем поместить на лед на пять минут и центрифугировать по 13 000 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант пипеткой. Затем промыть остаток 75% этанолом, 25% ОЧИЩЕННОЙ DEPC водой, затем центрифугировать при 13 000 г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
Снова удалите супернатант, высушите гранулы на воздухе в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем растворяют двухцепочечную РНК примерно 100 микролитрами воды DEPC и разводят ее до конечной концентрации 2 мкг на микролитр. Настройте программу в микроинъекционном насосе, чтобы обеспечить согласованность объема каждого впрыска.
Затем очистите шприц, заполнив его водой DEPC от 8 до 10 раз. Установите 10-микролитровый шприц на микроинжекционный насос. Затем запустите насос и заполните шприц 10 микролитрами двухцепочечного раствора РНК.
Обезболить тараканов углекислым газом, затем аккуратно подобрать их пинцетом и вручную доставить таракана к игле. Затем введите иглу через зазор между двумя брюшными сомитами горизонтально против эпидермиса. Введите двухцепочечный раствор РНК в таракана, гарантируя, что кончик иглы находится как можно ближе к эпидермису, чтобы избежать повреждения внутренних органов.
Наконец, вытащите кончик иглы. Поместите введенных тараканов в чистые контейнеры для биоанализа. Подождите около 10-20 минут, чтобы они оправились от воздействия углекислого газа.
Маркировка контейнеров с указанием даты инъекции, типа и дозы двухцепочечной РНК и возраста P.americana. Ddc или DOPA декарбоксилаза и Dpp или декапентаплегические гены были выбраны в качестве двух примеров для наблюдения фенотипа солодовых тараканов после инъекции двухцепочечной РНК и dsMocK, который не имеет цели у животных, был взят в качестве отрицательного контроля. Эффективность РНКи была обнаружена с помощью qRT PCR.
Гены были значительно сбиты со значением P менее 0,01 для dsDdc и менее 0,05 для dsDpp. P.americana с нокдаунными генами Ddc имел белый эпидермис из-за заблокированной меланизации. В эксперименте с инъекциями dsDpp РНК нарушала регенерацию конечностей.
Насекомые должны быть здоровыми и вводиться без вреда. Эта технология обеспечивает простой способ изучения функций генов для насекомых, которые не могут быть отредактированы генами, таких как американский таракан.
