Несмотря на то, что редактирование генов стало популярным для изучения молекулярной генетики не моделей организмов, РНК остается мощным синергетическим инструментом. Основным преимуществом этого метода является то, что он может быть применен к различным стадиям развития. Кроме того, частичный нокдаун может быть использован для изучения этих целых генов.
Успех процедуры зависит от инъекций DSR и с минимальным ущербом. Это требует практики, так что не отчаивайтесь, если это занимает несколько попыток, чтобы получить это право. Для подготовки эмбрионов ранней стадии для микро-инъекций, сначала залить кипения 20%agarose в небольшой чашке Петри и место три один-два миллиметра шириной пластиковых трубок на поверхность жидкой агарозы, прежде чем она затвердевает.
После того, как агароза затвердевла использовать пару тупых типсов, чтобы удалить трубки и покрыть в результате отступов с 500 микролитров автоклава дистиллированной воды. Когда контейнер для сбора готов использовать тонкую натуральную щетку краски для волос для передачи пяти восьмичасовых эмбрионов T.marmoratus из места гнездования жука в стеклянную полость блюдо, наполненное автоклавом дистиллированной воды под стерео микроскопом. С помощью микроскопа и тонкого вскрытия миппы схватить хорион каждого эмбриона с обеих сторон и рип хорион открытым позволяет эмбриону скользить мягко из ткани.
После удаления обоих слоев хориона со всех собранных эмбрионов используйте кисть, чтобы тщательно перенести эмбрионы из стеклянной полости в канавки подготовленной агарозной пластины. Для введения эмбрионов ранней стадии с геном конкретных двойных мель РНК сначала подготовить микроинъекции иглы на пульере иглы и использовать стерео микроскоп и найти миппы, чтобы сломать каждый кончик к резкому краю. После броска очищенных запасов двухструнной РНК интереса на льду, добавить один микролитер 10X инъекционный буфер в результате решения и использовать двойную дистиллированную воду, чтобы довести объем винила раствора до 10 микролитров.
Используйте P10 пипетку для заполнения одной из подготовленных микроинъекции иглы с рабочим двойным мель раствором РНК и загрузить иглу в держатель микроиглы подключен к системе микроинъекции, которая использует технологию выброса давления. Включите систему микроинъекции и под давлением подачи воздуха и использовать микро клапан на микроинъекции системы установить давление впрыска до 15 фунтов давления на квадратный дюйм затем использовать ручку регулировки времени, чтобы установить продолжительность инъекции до секунд. Для калибровки инъекционной иглы оценить объем жидкого пузыря, который образуется на кончике иглы при введении в воздух для эмбриона T.marmoratus использовать оптимальный размер пузыря от 100 до 200 микрон.
Игла впрыска хорошего качества если оптимальные пузыри можно достигнуть на 15 фунтах давления в квадратный дюйм с продолжительностью впрыска около 3 секунд. Когда игла настроена готова выровнять иглу на агарозной пластине эмбрионов так, что игла приближается к эмбрионам под углом от 45 до 60 градусов. Используйте микро-манипулятор, чтобы медленно перемещать микроиглу до тех пор, пока кончик не касается поверхности середины одного эмбриона, затем осторожно двигайте иглу вперед, пока она просто не проткнет поверхность эмбриона.
После того, как игла находится внутри эмбриона тщательно нажмите кнопку инъекции микро инжектора, чтобы доставить от одного до двух нанолитров двойной мель РНК в эмбрион. Когда вся РНК была доставлена медленно втягивать иглу из эмбриона, не вызывая эмбриона к разрыву. Успешно вводимые эмбрионы можно определить по наличию цветного пятна в месте инъекции.
Когда все эмбрионы были введены тщательно поместите блюдо в камеру влажности в 25 градусов по Цельсию инкубатор установлен на 14-часовой свет 10 часов темный цикл в течение четырех-пяти дней. Мониторинг прогресса развития эмбриона ежедневно под стерео микроскопом для выявления морфологически видимых фенотипов нокдауна. Использование цифровой камеры высокого разрешения для документирования процесса разработки.
Удалите все мертвые эмбрионы и пополняйте воду на агарозной пластине ежедневно, чтобы избежать высыхания и распространения микробного загрязнения на другие выжившие эмбрионы в инкубационный период. Перед сбором личинки сначала добавьте от 60 до 70 градусов по Цельсию 2%жидкий агароз в небольшую чашку Петри. Когда агароза затвердеет использовать тупые щипки, чтобы сделать одну неглубокую группу на личинку, которые будут введены в агарозу и осторожно слейте воду из чашек культуры личинки.
После анестезии используйте мягкие лопасти, чтобы аккуратно поместить личинку на обездвиживаемую пластину с шеями и телами в канавках, но хвост, расположенный над поверхностью агарозы. Когда все личинки были помещены, покрыть каждую лаву толстым слоем агарозы, которая все еще является жидкой, но не опасно горячей и бесплатно любые сказки, которые были случайно покрыты по мере необходимости. для двойной мель РНК микроинъекции нагрузки микроиглы с геном конкретных двойной мель РНК рабочего решения интерес, как попродемонстрировано.
Redrag поршень ручного управления микроинъекции шприц и загрузить иглу на микроинъекции системы. Распоитие обездвиженные личинки под стерео микроскопом таким образом, чтобы место инъекции выровняли с траекторией микроинъекции иглы под относительно плоским углом. Используйте микро-манипулятор, чтобы осторожно переместить кончик иглы в личинку и медленно и осторожно оказывать давление на шприц, регулируя давление инъекций в зависимости от движения цветной жидкости инъекции в игле по мере необходимости.
Когда все РНК была введена использовать мягкие типсы, чтобы освободить личинку от агарозы и поместить личинку в новый контейнер воды комнатной температуры на 25 до 28 градусов по Цельсию и 14-часовой свет 10 часов темного цикла. В этом репрезентативном анализе три различных гена были сбиты на различных стадиях развития солнечного жука T.marmoratus. РНК-интерференция выполняется, о чем свидетельствует введение двухструнной РНК на очень ранней стадии эмбриогенеза.
Некоторые эмбрионы не выживают в процессе и превращаются в некротические. На этих изображениях они контролируют человека и человека с немного светлее цвет глаз можно наблюдать. В этом человеке, более серьезный нокдаун, в котором более брюшной лежит кластера полностью unpigmented но делать союзники по-прежнему показывают некоторые пигментации можно наблюдать.
Здесь показан пример другого человека с существенно полной потерей пигмента во всех глазах. Lac2 сбил в личинках приводит к менее пигментированной кутикулы, легкие взрослые люди с несколько деформированных крыльев, вероятно, из-за необычной мягкости ткани были также получены. Будьте уверены, чтобы внимательно следить за вашими инъекционных животных на ежедневной основе и немедленно удалить любые мертвые лица.
Сила этого метода в том, что он может быть применен к генам многих различных организмов. Этот метод также широко и успешно применяется в эволюционной биологии развития.
