Сепсис - это нерегулируемый иммунный ответ хозяина на микробную инвазию или повреждение тканей, приводящий к повреждению органа в месте, удаленном от инфекции или повреждения. Широкая общественность стала более осведомлена об этом расстройстве во время пандемии COVID-19. В 2017 году во всем мире было зарегистрировано 48,9 миллиона случаев сепсиса и 11 миллионов смертей, что составляет почти 20% всех глобальных смертей.
Как и следовало ожидать, большинство случаев приходится на больницы. Фактически, исследование показало, что почти 62% положительных изолятов от пациентов в отделениях интенсивной терапии с сепсисом были грамотрицательными организмами. Существует несколько моделей, и некоторые из часто используемых моделей сепсиса на мышах включают эндотоксемию, вызванную ЛПС, модель перевязки и пункции цедры и модель монобактериальной инфекции.
В нашей лаборатории мы стандартизировали модельную систему для мышей, чтобы вызвать перитонеальный сепсис с использованием Salmonella Typhimurium. Эта модель выгодна перед другими, так как Salmonella Typhimurium является внутриклеточным патогеном, который имитирует клинически значимое состояние грамотрицательного сепсиса. Исход сепсиса перитонита в этой модели является системным со 100% смертностью, в течение 96 часов после заражения.
Таким образом, эта модель играет важную роль в изучении воспалительных реакций хозяина. В этой модели сепсис индуцируется внутрибрюшинной инъекцией 0,5 миллиона КОЕ Salmonella Typhimurium у 8-10-недельной мыши C57BL/ 6. Системная инфекция может быть подтверждена путем оценки бактериальной нагрузки органов примерно через 16 часов после заражения.
Эксперименты с использованием Salmonella Typhimurium требуют установки BSL-2 и соблюдения рекомендаций BSL-2. Необходимо соблюдать осторожность в использовании надлежащих СИЗ, а также в обеспечении безопасности, а также в соблюдении стандартных методов удаления биологической опасности BSL-2. Все эксперименты были одобрены институциональным комитетом по этике животных.
Культуральное приготовление сальмонеллы Typhimurium. Добавьте сто микролитр бульона сальмонеллы Typhimurium NCTC 12023 в 3 мл бульона LB. Высиживайте культуру со скоростью 160 оборотов в минуту, при 37 градусах Цельсия в течение ночи.
Протрите 50 микролитров выращенной на ночь культуры в бульоне LB на пластине агара Salmonella Shigella и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 12 часов. Выберите одну колонию из полосатой агаровой пластины SS, используя микроконечок. Вытолкните микрокончик в 3 мл бульона LB и культивируйте при 160 оборотах в минуту при 37 градусах Цельсия в течение ночи.
Добавьте 0,1 мл бактериальной культуры в 50 мл бульона LB и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в шейкерном инкубаторе при 160 об/мин в течение трех-четырех часов, чтобы достичь логарифмической фазы роста. Разбавить культуру в два раза с помощью бульона LB. Измерьте оптическую плотность культуры на длине волны 600 нанометров света в спектрофотометре.
Как только ОД достигнет единицы, сделайте две аликвоты по 1 мл культуры в микрофьюжных пробирках по 1,5 мл. Центрифугируйте пробирки по 7, 750 г в течение 15 минут. Откажитесь от этого супернатанта и дважды промойте гранулу 1 мл 1XPBS.
Центрифугируйте пробирки по 7, 750 г в течение 15 минут. Повторно суспендировать гранулы в 0,5 мл 1XPBS, в двух разных микрофьюжных пробирках по 1,5 мл. Объедините суспензии из обеих трубок в одну трубку объемом 1,5 мл, содержащую теперь примерно две, умноженные на 10, поднятые до мощности восемь колониеобразующих единиц на мл.
Приготовьте бактериальную клеточную суспензию мощностью 10 сил шесть КОЕ/мл, разбавляя запасной раствор. Важное примечание, оптимизируйте КОЕ, соответствующий ОД в вашей лаборатории, чтобы определить КОЕ для ОД, прежде чем начинать эксперименты. Мыши и инфекции.
В день заражения подержите мышь одной рукой, протрите кожу живота 70% этанолом, а задние лапы раздвиньте для лучшей доступности брюшной стенки. Вводят 0,5 мл из 10 поднятых до мощности шести КОЕ/мл бактериальной суспензии внутрибрюшинно, с помощью шприца 1 мл. После заражения пластинчатая культура для проверки фактического введенного КОЕ, который может варьироваться от 0,2 до 0,8 млн КОЕ на 0,5 млн.
Оценка КОЕ органов. Мышь была принесена в жертву с помощью удушья углекислым газом. Принеся в жертву зараженную мышь, протрите живот кусочком хлопка, обмакнутым в 70% этанол.
Разрезать кожу живота. Обратитесь к статье Рэя и Диттла для видеопротокола о том, как собрать жидкость для промывания брюшины. Вскрываем брюшинную полость и собираем интересующий орган.
В этом видео мы демонстрируем перечисление КОЕ органов из печени. Печень подвергается обширному гистопатологическому повреждению, при этом модели сепсиса. Отрежьте небольшой кусочек печени и поместите его в микрофункциональную трубку.
Его можно хранить во льду в течение двух-трех часов, прежде чем перейти к следующему шагу. Взвесьте кусок и переложите его в микрофункционную трубку. Предпочтительно разрезать кусочки весом от 10 до 15 мг для надлежащей гомогенизации.
Добавьте 0,5 мл 1XPBS в пробирку и гомогенизируйте органы с помощью гомогенизатора рук. Убедитесь, что органы полностью гомогенизированы. Увеличьте объем до 1 мл, добавив 0,5 мл 1XPBS.
Центрифугируйте трубки при 200 G в течение пяти минут, при четырех градусах Цельсия. Соберите супернатант в свежие микрофрагмированные трубки. Приготовьте разведения 10 к мощности минус один, и 10 к мощности минус два, в плите из 96 лунок.
Выложите 50 микролитров разбавителя на свежие агаровые пластины SS и инкубируйте пластины при температуре 37 градусов цельсия в течение 12 часов. Подсчитайте количество колоний, которые появляются в каждом состоянии, и нормализуйте данные с массой органа, используя следующую формулу. КОЕ/мг равна количеству колоний, умноженному на 20, умноженному на коэффициент разведения, целое делится на массу органа в мг.
Обратите внимание, что число 20 используется в формуле, чтобы преобразовать колонии на пластину в КОЕ / мл. Это число получают путем деления 1 мл на количество данного объема покрываемой культуры. В этом случае 50 микролитров.
Например, если найти сотню колоний в агаровой пластине СС, где распределяется 50 микролитр 10 степеней минус одно разведение гомогенизированного органа, весом 10 мг, то КОЕ/мг будет равен 100 умноженным на 20, умноженным на 10, целое деленным на 10, что равно 2000 КОЕ/мг. Проточный цитометрический анализ различных популяций иммунных клеток в перитонеальном экссудате. Соберите перитонеальные клетки, как описано ранее, Рэем и Диттлом.
Повторное суспендирование клеточной гранулы из жидкости для промывания брюшины в 1 мл RPMI, дополненного 10% FBS. Перечислите общее количество клеток в перитонеальном лаваже с помощью гемоцитометра. Отрегулируйте номер ячейки таким образом, чтобы каждая трубка получала от двух до пяти умноженных на 10 поднятых до мощности пяти ячеек.
Раскрутите клетки вниз при 200 Г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Выбросьте супернатант. Вымойте ячейки один раз с помощью 1XPBS.
Центрифугируйте ячейки при 200 G в течение 10 минут. Блокируйте Fc-рецепторы с помощью блокатора FcR. Один из них составляет до 400 разведения, приготовленных в блокирующем буфере, состоящем из 5% FBS и 0,02% азида натрия в PBS.
Инкубировать на льду в течение 15 минут. Центрифугируйте ячейки при 200 G в течение 10 минут. Выбросьте супернатант.
Разбавляют фторхром конъюгированные антитела, представляющие интерес в блокирующем буфере. Здесь мы используем один до 500 разведения антимышечного Ly6G, чтобы окрашивать нейтрофилы. Обратите внимание, что другие популяции иммунных клеток также могут быть показаны, используя анти-мышиный B220 для В-клеток, анти-мышиный CD3 для Т-клеток, анти-мышиный F4/80 для макрофагов и так далее.
Инкубируют около 0,2 млн клеток в 200 микролитрах разбавленных растворов антител, в отдельных пробирках. В качестве отрицательного контроля отложите по одной трубке в каждом типе фторхрома для незапятнанного контроля. В этой трубке инкубируют клетки с 200 микролитрами блокирующего буфера без антител.
Инкубируйте образцы на льду в течение 45 минут, с прерывистым постукиванием каждые 15 минут. Центрифугируйте клетки при 200 G в течение 10 минут, при четырех градусах Цельсия. Выбросьте супернатант.
Зафиксируйте клетки 4%-ным параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре, при необходимости хранить в течение нескольких дней. Повторное суспендирование клеток в 200 микролитрах буфера окрашивания FACS, 2% FBS в PBS. Получить данные в проточном цитометре.
Изображения агаровых пластин SS, показанные здесь, указывают на нагрузку на орган КОЕ в печени и селезенке септических мышей. Гомогенизированные органы Lys6 распределяли при разведении 10 до степени минус один, и инкубировали при 37 градусах Цельсия. Чернопигментированные колонии S.Typhimurium появились примерно через 12 часов после инкубации.
Часть пластины показана здесь в виде увеличенной вставки, чтобы выделить колонии. Эти результаты свидетельствуют о том, что возбудитель успешно распространяется системно, и колонизирует внутренние органы. На этом рисунке показаны сыворотки, изолированные от здоровых и септических мышей.
Объем собираемой крови у септических мышей меньше, чем у здоровых контрольных, поэтому полученная сыворотка меньше. Это происходит из-за повышенной коагуляции при сепсисе. Также сыворотки от септических мышей, показывают отчетливую красную окраску, свидетельствующую о возникновении обширного гемолиза.
На рисунке показаны цитометрические графики перитонеальных клеток здоровых и септических мышей, окрашенных антителами против Ly6G. Эти изображения являются репрезентативными для одной здоровой и двух инфицированных мышей. У септических мышей наблюдалась повышенная инфильтрация нейтрофилов в брюшинную полость.
В этом видео мы показали метод индуцирования бактериального сепсиса у мышей, путем внутрибрюшинной инъекции Salmonella Typhimurium. Это полезная модель для изучения эффектов терапевтических вмешательств при ослаблении сепсиса. В этой модельной системе клеточный состав брюшинной полости резко изменяется с целью борьбы с возбудителем.
Таким образом, это полезная модель, при изучении кинетических изменений в составе и функциях иммунных клеток во время сепсиса. Модель также полезна для понимания увеличения межклеточных активных форм кислорода, провоспалительных уровней цитокинов, гемолиза и свертывания крови, все из которых происходят во время сепсиса.
