Фиброз тканей является основным способом, что органы терпят неудачу с течением времени, в ответ на хроническое воспаление или старение. И в самом деле, я бы сказал, что если вы не умрете от инфекционного агента или рака, вы, вероятно, умрет от фиброза органов, как вы возраста. К сожалению, есть не так много больших моделей мыши, чтобы имитировать фиброз тканей человека.
Итак, мы разработали модель мыши болезни Крона, это болезнь у человека, которая вызывает фиброз кишечника и в значительной степени неизлечима. В самом деле, единственный способ вы можете лечить это через хирургическое удаление фиброзной ткани и повторной перевязки кишечника. Преимущество нашей модели заключается в том, что она полностью покоилась во всех штаммах мыши и очень тесно имитирует болезнь человека Крона, и фиброз сохраняется уже более месяца, что является действительно надежной моделью.
Наиболее сложной частью этой процедуры является обработка мышей и особенно устные gavage так как это требует много практики специальной сертификации. При выполнении этой процедуры в первый раз, следует знать, что работа с сальмонеллой требует надлежащих мер предосторожности и стерильной техники. Утилизация отходов и бактерий должна быть запланирована до начала эксперимента.
Визуальная демонстрация этой процедуры очень важна, потому что она включает в себя обработку сальмонеллы, которая требует специальных мер предосторожности, а также надлежащей стерильной техники. Чтобы начать эту процедуру, установите пластину с Агаром LB, содержащую стрептомицин в концентрации 100 микрограмм на миллилитр. Используя стерильную инокулятную петлю, протрите пластину замороженным запасом глицерола стрелки дельты S typhimurium a.
Инкубировать ночь при 37 градусах по Цельсию. Полосовые пластины могут храниться при четырех градусах Цельсия в течение одной недели. За день до заражения растворите 0,5 грамма стрептомицина в 2,5 миллилитров воды для приготовления антибиотика.
Фильтр стерилизовать раствор стрептомицина. Затем используйте лампу наконечником 22 калибра гаваж иглы с одним миллилитров шприц устно gavage мышей с 100 микролитров стрептомицина решения. Затем добавьте три миллилитров бульона LB, содержащего стрептомицин в концентрации 50 микрограмм на миллилитр, в культурную трубку.
Используя петлю прививки, привить бульон LB с одной колонией. Инкубировать культуру аэробно ночь на 37 градусов по Цельсию с тряской на 200 об /мин. В день заражения, выполнить два последовательных от одного до 10 разбавления ночь сальмонеллы культур с стерильными PBS подготовить окончательную дозу инфекции.
Это приводит к 100 микролитер инокулум, содержащий около трех миллионов единиц формирования колонии. После этого используйте лампу наконечником 22 калибра гаваж иглы с миллилитровый шприц, чтобы gavage каждой мыши с 100 микролитров подготовленных сальмонеллы. Во-первых, изучат два миллилитров безопасного замка круглые нижние микротрубки, добавить один миллилитр стерильных PBS и автоклавной шарик из нержавеющей стали для каждой трубки.
Предварительно взвесить трубки до сбора тканей. После усыпления мышей, повторно их cecal и splenic тканей, убедившись, что собирать ткани из отдельных животных в отдельные трубки. Взвесь каждую трубку, чтобы определить вес ткани.
Используйте прибор смесителя мельницы для гомогенизации тканей на 30 герц в течение 15 минут. Затем перенесите 900 микролитров PBS в каждый колодец 96-ну два миллилитров мегаблока. Pipette 100 микролитров ткани гомогенирует в первую колодец, и хорошо перемешать.
Выполняем серийные разбавления, добавляя 100 микролитров к последующим скважинам, пока не будет получено от 10 до отрицательного шестого разбавления. Плита 10 микролитров каждого разбавления в трипликатах на LB агар, который содержит стрептомицин. Затем подсчитайте средние единицы формирования колонии и определите единицы формирования колонии на грамм ткани, как указано в текстовом протоколе.
Откройте Фиджи, которая является открытым исходным кодом изображения программного обеспечения и перетащить и падение tif файл изображения на бар инструментов. В баре меню выберите стек Image, Type, RGB, чтобы разделить изображение на красные, зеленые и синие каналы. Сдвиньте горизонтальную планку в нижней части панели, чтобы установить канал на зеленый.
Открытое изображение, Отрегулируйте, Пороговый инструмент. Отрегулируйте минимальные и максимальные ограничения для устранения любых фоновых сигналов. После того, как желаемый порог установлен, закройте пороговый инструмент и перейдите на анализ, установить измерения, проверить площадь, площадь фракции, предел порога и отображения этикетки.
Получить выбор тканей либо от руки выбор или полигон выбор инструмента и измерить процент области положительный для коллагена, нажав Анализ, Мера. Затем нормализуют абсолютную область положительной для коллагена окрашивания в области тканей. Лечение стрептомицина с последующим пероральной инфекцией со стрелкой дельты S typhimurium приводит к надежному воспалению кишечника и фиброзу, особенно в cecum.
Типичные патогенные нагрузки от 100 миллионов до одного миллиарда единиц формирования колонии могут быть восстановлены на грамм cecum от инфицированных животных, в то время как 10 тысяч колоний формирования единиц, как правило, могут быть восстановлены на грамм селезенки. Оценка фиброза в пикрозий красных окрашенных секций cecal указывает пик фиброз 21 дней после заражения, в то время как большая часть патологии решается на день 42 после инфекции. Тщательная подготовка материалов имеет важное значение, поскольку этот эксперимент требует нескольких дней, чтобы настроить.
Подготовка пластин LB и сальмонеллы и стрептомицина все должно быть сделано асептически. Перед началом эксперимента убедитесь, что экспериментатор знаком с протоколом животных, а также с опасностями безопасности. При оценке бремени коллагена экспериментатор может выбрать для выполнения других биологических анализов, таких как секвенирование РНК для оценки профилей экспрессии генов или цитометрии потока для оценки подмножества иммунных клеток или ткани ELISA для оценки профилей цитокинов.
Так что наша модель особенно хороша в имитации болезни человека, называемой болезнью Крона, где вы получаете фиброз кишечника, который в значительной степени неизлечим и единственный способ, которым вы можете лечить это, чтобы удалить часть кишечника и сшить его обратно вместе и надеюсь, что он не вернется. Наша модель очень надежна, и мы уже показали, что таргетинг врожденных лимфоидных клеток типа 3, транскрипционный фактор, называемый сырой альфа, или интерлеукин 17, амелиорирует болезнь и предотвращает фиброз. Наша модель особенно хороша в выявлении факторов, которые играют в патогенезе болезни Крона и фиброз кишечника, и мы уже на пути к выявлению ряда целей, которые можно лечить терапевтически, чтобы облегчить воспалительные заболевания кишечника.
Наша модель уже вступила же ILC3 или альфа NIL17 доступ может быть в игре в других фиброзных заболеваний, и они включают в себя такие вещи, как псориаз, рассеянный склероз, идиопатический легочный фиброз. Так что вполне возможно, что ориентации этих же факторов может облегчить фиброз в этих заболеваниях, а также. Хотя поток мутантов сальмонеллы не вирулентный, важно следовать стандартным протоколам безопасности биоопасной опасности, данным объектом.
Кроме того, поскольку пары формальдегида, как известно, канцерогенные, важно работать за капотом дыма во время шага фиксации.
