Модель cecal slurry для полимикробного сепсиса является мощным инструментом для вскрытия уникальной неонатальной патофизиологии. Она может быть переменной, и гуманные конечные точки не очень хорошо описаны. Здесь мы представляем нашу стандартизированную процедуру для подготовки cecal суспензии и введения в экспериментальных животных.
Кроме того, мы используем подход, управляемый данными, для выявления умирающих щенков в кратчайшие сроки. Начнем с подготовки замороженных cecal суспензии фонда. Это делается путем объединения cecal concent из по крайней мере пять взрослых мышей, приостановление в стерильной воде декстрозы, и хранение при температуре минус 80 для более длительного использования.
Вы можете использовать мужчин или женщин, но пол, возраст и фон мышей для ваших экспериментов должны быть постоянными. Во-первых, давайте подготовим наши инструменты для вскрытия. К ним относятся набор ножниц и типсов для кожи и второй набор для внутренних органов.
Включите стерилизатор горячего бисера по крайней мере за 30 минут до использования. Опустите инструменты в 70%ethanol, а затем погрузить их в горячей стерилизатор бисера, по крайней мере одну минуту. Спрей коврик из бумажных полотенец с 70% этанола, а затем удалить инструменты из стерилизатора, не касаясь стерилизованной части инструмента, чтобы нестеринные ручки других инструментов.
Поместите их на бумажное полотенце, чтобы остыть. Рассекают мышей в шкафу биологической безопасности. Прикрепите ноги мыши к доске пенополистирола с помощью 23 калибровочных игл, чтобы мышь живот вверх.
Спрей брюшной полости с 70%этанола. Используя стерильные типсы и ножницы, прорезать кожу, ослабить кожу от брюшной подкладки ножницами, и разрезать прямоугольную область от паха до грудины и с левой стороны на правую сторону. Удалите мех вокруг брюшной полы.
Переключитесь на новую пару стерильных инструментов, чтобы прорезать брюшной полости, а также сделать прямоугольное отверстие. Определите cecum, который должен работать с левой стороны на правую сторону по всему телу. Нарушить соединительной ткани для выявления ветвей cecum из кишечника и сократить cecum от кишечника.
Поместите его на стерилизованный лист бумаги для взвешивания. Используя стерильные инструменты, прорезать оба конца cecum. Держите середину cecum с типсами и используйте плоский металлический шпатель, чтобы мягко нажать содержимое cecal из концов с помощью подвижного движения.
Соберите содержимое и поместите их в предварительно взвешенную 15-миллилитровую центрифугу. Содержимое бассейна из максимум пяти мышей в ту же трубку. Вес трубки снова, как только все содержимое были добавлены.
Чтобы рассчитать объем декстрозы воды, чтобы добавить к содержимому cecal в каждой трубке, разделить вес содержимого cecal в трубке по желаемой концентрации в миллиграммах на миллилитр. Держите aliquot воды декстрозы на льду для повторной приостановки содержимого cecal. Добавьте необходимое количество воды декстрозы в 15-миллилитровую центрифугу, содержащую содержимое цикала.
Вихрь трубки вертикально и горизонтально в течение примерно 30 секунд. Наблюдайте за наличием твердых частиц диаметром более нескольких миллиметров и, если таковые имеются, продолжайте вихрь до тех пор, пока все частицы не исчезнут. Поместите 50 миллилитровую центрифугу трубку на лед, чтобы собрать фильтрат и установить стерильный 70 микрометровый ситечко клеток сверху.
Pipette четыре миллилитров повторно приостановлено суспензии из одной 15 миллилитров трубки над клеткой ситечко и в коллекторной трубке. Повторно приостанавливать частицы путем трубопроводов вверх и вниз два-три раза. Аккуратно экструдирование пузырьков для увеличения скорости фильтрации при перемешивании содержимого с кончиком пипетки, пока нет больше жидкости фильтруется.
Это должно занять около 30 секунд. Изменение ячейки ситечкой между каждой трубкой cecal суспензии, но объединить все содержимое в той же 50 миллилитров трубки сбора. Если ваш запас превышает 40 миллилитров, то вихрь его в течение 15 секунд, и место 20 миллилитров в новую трубку центрифуги.
Разделите суспензию на криогенные флаконы по 500 микролитровых алицитов каждый. Вихрь суспензии между каждые три флакона. Храните главный запас во флаконах на льду.
Путем хранить aliquots на минус 80, аэробная колония формируя концентрацию блока в подготовке cecal суспензии не меняет над шестимесячным периодом. Теперь, когда cecal суспензии подготовлен, мы можем использовать его, чтобы бросить вызов помет семи до восьми дней мышей с скорректированной на вес дозы cecal суспензии. Летальность суспензии зависит от дозы.
Вам придется определить желаемую смертельную дозу в вашем учреждении для каждого нового запаса с новой дозой titration. Один cecal суспензии инъекции aliquot готовится на помет. Мы нормализуем инокулум до 100 микролитров, округляя до ближайших 10 микролитров для каждого животного в помете.
Подготовка вызова aliquot требует трех расчетов, объем шлама запасов требуется, дополнительный объем воды декстрозы, и округлый объем для каждого щенка в помете. Подробную информацию о том, как выполнить каждый расчет, можно найти в разделе 3 протокола. Выполнение этих расчетов вручную для каждого эксперимента может быть трудоемким и будет способствовать экспериментальной ошибке, таким образом, электронная таблица может быть загружена вместе с протоколом, где вы вводите концентрацию запасов, желаемую дозу и вес вашего помета, и количество шлама запасов, объем воды декстрозы, и фактический объем на щенка автоматически возвращается.
Вы можете распечатать этот лист и взять его с собой, когда вы будете готовы бросить вызов своим животным. Подготовьте инъекцию aliquot в биологическом шкафу безопасности и держать его на льду. Перед загрузкой шприца смешайте микроцентрифугную трубку, щелкнуть 20 раз.
Детеныши оспариваются с 28 калибровочный инсулин шприц. Перед составлением суспензии, смешать aliquot, вдохновляя и выбрасывая от 300 до 500 микролитров вызов aliquot в и из микроцентрифуг трубки. Затем, составить около 150 микролитров вызов aliquot.
Это должно быть больше, чем объем инъекций для любого семи-восьмидневного щенка. Флик на шприц, чтобы выбить пузырьки из поршеня и отступить немного на шприц, чтобы изгнать любые пузырьки воздуха. Не прикасайтесь к игле или валу поршеня во время этого процесса.
Распределять излишки cecal суспензии обратно в трубку микроцентрифуг до расчетного количества cecal суспензии для мыши загружается в шприц. Cecal суспензии вводят с интраперитонеальной инъекции. Выполните это в соответствии с протоколом в вашем учреждении по уходу за животными.
Чтобы свести к минимуму утечки, наклоните щенка лицом вниз и вставьте иглу между ногой и гениталиями, сохраняя иглу мелкой и подкожной. После вставки иглы около одного сантиметра, нажмите вниз и вперед, пока вы не почувствуете прокол иглы брюшной полышкой, а затем медленно угнетают поршень. Тщательно свяйте иглу по тому же маршруту, что и вы вошли, расслабляя средний палец, как вы это делаете.
Обратите внимание на любые утечки в вашем лабораторном блокноте и рассмотреть вопрос о опуская животных с существенными утечками из вашего конечного результата. В этом разделе мы наметим различные уровни здоровья, которые мы наблюдаем у мышей, сталкиваются с полимикробным сепсисом и соответствующей гуманной конечной точкой. Для любых процедур с участием неонатальных мышей, мы переасывали материал постельных принадлежностей в новую клетку.
Это передает запах дамы на перчатки и уменьшает нагрузку на даму от повторного входа в ее клетку. Мы делаем второе гнездо в новой клетке, чтобы держать контролируемых щенков до конца процедуры или мониторинга, когда весь помет готов к вернуться в клетку дамы. Поместите мышь на спину и монитор для способности право в течение четырех секунд.
Если это правильно, то подождите еще восемь секунд, чтобы определить уровень мобильности. Неоспоримая или восстанавливающаяся мышь чаще всего может правильно и исследовать свою среду, принимая несколько шагов подряд. Перегруппировать мышей, которые в состоянии исправить себя и сделать несколько шагов, чтобы изучить его окружающую среду в качестве прав-летаргических.
Эти мыши могут упасть, делая шаг и выглядеть шатким на ногах. Мышь, которая не в состоянии право и имеет движение бедра, что превышает 90 градусов от горизонтальной мы группы, как не вправо-мобильный. Эта мышь в конечном итоге право, но не может в течение четырех секунд.
Из-за своих движений вальмы, оно сгруппировано как отказ к right-mobile. Детеныши, которые не смогли право и имеют хип движения ниже 90 градусов от горизонтальной сгруппированы как не в право-летаргической. Это еще один пример мыши, чьи бедра не превышают 90 градусов от горизонтальной и сгруппированы как не в право-летаргической.
Не в состоянии право-немобильный щенок будет иметь ноги, которые могут трясти или вибрировать, но не имеют хип движения. Конечности могут расширяться и втягиваться, но не будут иметь бокового движения. Детеныш явно болен и достиг гуманной конечной точки.
Это еще один пример не в состоянии право-немобильный щенок. Его бедра не трясутся слева направо, но лапы вибрируют. При обращении с клеткой дамы, щенков можно вытащить из гнезда, если медсестра дама работает.
Мы заменяем их, а затем проверить на другие рассеянные щенки, которые находятся вдали от своих соседей гнезда. Если эти рассеянные щенки не в состоянии право-летаргических, они находятся в гуманной конечной точке. Вот Каплан-Мейер кривой выживания нашей модели сепсиса.
Точки времени мониторинга можно найти в прилагаемом SOP. В любой момент вдоль кривой выживания, если мышь оказалась не в состоянии право-немобильный, он находится в своей гуманной конечной точке и усыпан. Между 12 и 21 часов после вызова, мыши будут появляться больными и около половины мышей смогут прямо на одной стороне, в то время как другая половина не в состоянии прямо на любой из их сторон.
Это сроки, когда мыши начнут отступать в оценка здоровья и достичь гуманной конечной точки не вправо-немобильный. Это репрезентативные результаты оценки состояния здоровья, наблюдаемые в этот период времени. Выжившие и не выжившие группы не могут быть дифференцированы на данный момент на основе их оценки здоровья.
В этой стадии заболевания, от 21 до 48 часов после вызова, мы наблюдаем самую высокую долю гуманных конечных точек. Мы также заметили, что подавляющее большинство мышей, которые не в состоянии право с обеих сторон не будет в конечном итоге оправиться от болезни, которая, следовательно, становится новым критерием для гуманной конечной точки в дополнение к не в состоянии право-немобильных критериев. Наблюдаемые оценки состояния здоровья на этой стадии заболевания привели к отделению выживших от выживших.
Подавляющее большинство мышей, которые были не в состоянии право с обеих сторон не оправиться от болезни. Эти данные подтверждают, что новым критерием гуманной конечной точки, начиная с 21 часов после вызова, должно быть усыпание любых мышей, которые не могут правильно с обеих сторон. В течение 48 часов после вызова многие мыши начнут отображать больше активности и лучше правый рефлекс.
Несмотря на то, что доля гуманных конечных точек ниже в этот период, мыши все еще могут отступить и заболеть, и они по-прежнему требуют мониторинга для гуманной конечной точки. В течение этого периода времени, некоторые из тех мышей, которые в конечном итоге были сгруппированы как не выжившие показали повышенную активность в одной точке, но позже сделал хуже и достигли гуманной конечной точки. Это требует дальнейшего мониторинга больных животных с повышенной частотой, если они начинают показывать худшие результаты для здоровья.
Независимые экспериментаторы, которые не получили личной подготовки и которые только наблюдать это учебное видео были проверены в их способности назначить тот же балл, как следователи, используя записанные видео испытаний. Это учебное видео приводит к точной поведенческой классификации. Способность назначить правильный балл, чтобы не право-немобильных неонатальных мышей, которая является мерой гуманной конечной точки, была определена из 60 неонатальных мышей, и в среднем 97% поведения были точно различимы, и только 3% были неправильно идентифицированы.
Затем была проверена способность дифференцировать неонатальных мышей, которые не смогли правильно или которые смогли правильно в течение четырех секунд. Это еще одна мера гуманной конечной точки и была точно назначена в 97% неонатальных мышей, в то время как 3% щенков были неправильно назначены в качестве прав. Вот репрезентативные результаты для процентов изменения веса мышей по сравнению с их время вызов.
Среднее изменение веса между выжившими и не выжившими начали отделяться в течение 24 часов после вызова, но есть много совпадений между группами. Были некоторые выжившие, которые потеряли более 20%веса, но все еще оправился от болезни. Изменение веса было не так эффективно в прогнозировании результатов по сравнению с различиями в оценках здоровья, поэтому оно не используется в качестве критерия при определении того, находятся ли мыши в гуманной конечной точке.
В заключение, теперь вы должны быть в состоянии подготовить запас замороженных cecal суспензии, рассчитать скорректированную на вес дозу. И вводить и контролировать новорожденных мышей для гуманных конечных точек. Мы надеемся, что это будет ценным ресурсом для ваших исследований мыши.
