Натуральные продукты часто биосинтезированы как класс соединений, а не как единый продукт. Диагностическая фрагментация фильтрации является простым подходом для обнаружения всех структурно связанных соединений в сложной смеси. Диагностическая фильтрация фрагментации, реализованная в программном обеспечении МЗмин, позволяет аналитику исследовать наборы данных масс-спектрометрии для новых натуральных продуктов, которые в противном случае были бы пропущены.
Это включает в себя новые биопродукты, а также новые токсины. Диагностическая фрагментация фильтрации, применяемая к классам токсинов, которые загрязняют пищу и воду, может информировать оценки воздействия. При применении к микробным и растительным экстрактам, это может привести к открытию новых соединений.
Использование диагностической фрагментации фильтрации требует понимания ключевых функций масс-спектрометрии тандема, определяющих химический класс. Это означает, что структурно аналогичные соединения будут генерировать характерные ионы. Меня зовут Шон Хугстра.
Я специалист по исследованиям и разработчик программного обеспечения в нашем центре, и я буду демонстрировать процедуру. Чтобы подготовить образец для анализа микроцистина, привить 30 миллилитров стерильных цианобактерий роста среднего примерно в пять раз-к-пятой клетки на миллилитр, в асетических условиях, в 250-миллилитровых колбы Erlenmeyer, мониторинг плотности клеток с гемоцитометром. После 26 дней фотоавтотрофной культуры, освещенной прохладным белым флуоресцентным светом с использованием 12-часового светло-темного режима при 27 градусах Цельсия, с закрученной один раз в день, используйте 47-миллилитровый диаметр GF/C стеклянные фильтры микрофибер для того чтобы отделить клетки от среды культуры вакуумной фильтрацией.
Добавьте три миллилитров 80%метанола в собранные клетки в 14-миллилитровых пробирках, и вихрь, а затем sonicate каждой трубки в течение 30 секунд. После sonication, lyse образцы с тремя последовательными один час, минус-20 градусов по Цельсию заморозить, и 15-минутная комнатная температура оттепели циклов, и фильтровать каждый результат цианобактерий клеточный экстракт через отдельные 0,22-микрометровый фильтры полиэтиленовых шприцев. Используя нежный поток азотного газа, высушите экстракты испарителем при температуре 30 градусов по Цельсию и храните экстракты сухими при температуре минус 20 градусов по Цельсию.
Для анализа жидкой хроматографии тандема масс-спектрометрии, восстановить высушенные остатки для анализа с 500 микролитров 90% метанола, и вихрь образцов в течение 30 секунд. Перенесите в янтарь жидкий хроматографический флакон высокого давления. Затем проанализируйте экстракт цианобактерий с помощью метода получения данных на масс-спектрометре высокого разрешения в соответствии со стандартными протоколами.
Большинство микроцистинов содержат остатки АТА, который производит два диагностических ионов продукта в тандеме масс-спектрометрии, M через No 135.0803, и 163.1114. Для нецелитической жидкой хроматографии тандем масс-спектрометрии набор данных подготовки, открыть МЗмин 2, и выбрать сырье импорта данных "в соответствии с методами сырье данных" падение вниз меню. Затем выберите файлы данных из анализа микроцистина и выберите фильтр пикового выбора для применения алгоритма центроидирования, поставляемого поставщиком.
Для диагностической фрагментации фильтрации, или DFF, импортированных файлов приобретения, зависящих от данных, используйте курсор для выделения файлов данных и откройте меню Visualization"drop-down для выбора опции DFF. В поле диалога DFF, которое появляется, ввнося диапазон времени хранения и минут, когда целевой класс аналитов будет elute, и найти диапазон соотношения массы к зарядке целевого класса аналитов, в том числе возможность для нескольких заряженных соединений, когда это необходимо. Ввнося достижимую тандемную масс-спектрометрию массовой точности прибора масс-спектрометрии, ввнося класс-специфические ионы продукта в соотношение массы к заряду.
Введите нейтральные потери класса и определите минимальную интенсивность ионов диагностического продукта и/или нейтральных потерь, которые будут рассматриваться в процентах от базового пика спектрометрии тандема. Затем выберите путь и имя файла, чтобы выработать результаты и нажмите OK ", чтобы начать DFF. Сюжет DFF появится после успешного завершения установки.
Аналитик должен интерпретировать тандемные массовые спектры известных соединений в составном классе для определения ионов продукта и/или нейтральных потерь, которые диагностичны для всего класса соединений. Этот сюжет DFF был создан после анализа M.aeruginosa CPCC 300. Х-ось представляет это соотношение массы к заряду ионов-предшественников, удовлетворях которым удовлетворяли определенным критериям DFF, в то время как у оси показывает соотношение массы к заряду всех ионов продукта в микроцистиновом тандеме масс-спектрометрии.
Для этого анализа критерии обнаружения микроцистина включали ионы-прекурсоры в соотношении массы к зарядке от 400 до 1200 и время удержания от двух до шести минут. Самое главное, эти тандемные спектрометрические спектрометрии тандема содержали оба соотношения массы к заряду выше установленного порога пиковой интенсивности в 15%. Из 4, 116 тандемных спектрометрии тандема, приобретенных в ходе анализа, 26 удовлетворяли критериям DFF и были обнаружены в экстракте M.aeruginosa CPCC 300.
Основные микроцистины обнаружены могут быть уверенно назначены в качестве микроцистина лейцин аргинина и деметилированной аспарагиновой кислоты микроцистина аргинина. По мере того как новые соединения открынные используя диагностическую фильтрацию фрагментации, организмы можно вырастить в большом маштабе для изоляции и характеристики соединений NMR. При применении к микроцистинам, диагностическая фрагментация фильтрации позволяет нам определить, если традиционные методы целевого скрининга обнаруживают основные токсины, присутствующие в образце.
