Этот протокол важен тем, что позволил выявить, содержал ли образец пациента патогенные антитела. Основное преимущество этой методики заключается в ее способности дифференцировать реактивность между поверхностными и внутриклеточными антигенами, которые не могут быть легко различимы другими методами. Культурные нейроны гиппокампа используются для идентификации новых антител.
Идентификация этих новых антител в конечном итоге позволяет инициировать специфическую монотерапию для улучшения результатов лечения пациентов. Этот метод важен, потому что он может быть распространен на всю область заболеваний, связанных с патогенными антителами, направленными на поверхностные белки нейронов. Удерживая голову эмбриона тонкими изогнутыми щипцами, пронзите орбиты парой мелких прямых щипцов под углом 45 градусов.
Затем отпустите мелко изогнутые щипцы. С помощью хирургических ножниц рассекают кожу и череп, начиная от затылочной кости до лобной кости. Затем удалите мозг парой тонких изогнутых щипцов и соберите его в шестисантиметровую чашку с гибернацией плюс B27.
Как только мозг всех эмбрионов будет восстановлен, используйте тонкие прямые щипцы, чтобы сагиттально отделить теленцефалоны. Затем приготовьте 10-сантиметровую тарелку, поместив капли спячки плюс B27 на расстоянии одного сантиметра по кругу, и поместите один теленцефалон на каплю, чтобы визуализировать через рассекающий прицел при увеличении 1,25 X. Во время работы под микроскопом осторожно удалите таламус и очистите мозговые оболочки, чтобы лучше визуализировать гиппокамп.
Затем рассекните гиппокамп точными пружинными ножницами. И поместите его в 3,5-сантиметровую тарелку с гибернацией плюс В27 и истреть две. Повторите процедуру, чтобы собрать все гиппокампы.
Для ферментативной диссоциации гиппокампа добавьте один миллилитр 2,5% трипсина в 50-миллилитрную трубку, содержащую гиппокамп. Доведя объем в тюбике до пяти миллилитров с HBSS, инкубируйте трубку в течение 15 минут на водяной бане при 37 градусах Цельсия. Чтобы дополнительно разбавить трипсин, добавьте 10 миллилитров предварительно нагретого HBSS, и поместите трубку обратно в водяную баню, установленную при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.
Затем используйте микропипетку объемом 1000 микролитров для переноса гиппокампа, появляющегося в виде слизевой массы, в трубку размером 50 миллилитров. И инкубируйте ткань с шестью миллилитрами предварительно нагретого HBSS в течение пяти минут, как показано. Чтобы механически диссоциировать ткань, перенесите массу гиппокампа в двухмиллилитровую трубку с коническим дном.
После добавления одного миллилитра предварительно нагретой среды DMEM гомогенизируйте гранулу микропипеткой 1000 микролитра, осторожно аспирируя вверх и вниз. Следя за тем, чтобы не образовывались пузырьки, повторите аспирацию вверх и вниз 10-20 раз предварительно вытянутой стеклянной пипеткой с коническим концом, контактирующим с коническим дном трубки, пока смесь не станет полупрозрачной. Подсчитайте клетки, прежде чем распределить их равномерно на 3,5-сантиметровой тарелке со скрещенными встряхивающими движениями.
После этого поместите блюдо в инкубатор с 5% углекислым газом. Для флуоресцентного иммуноокрашения 14-дневных клеток in vitro добавьте образец, содержащий антитела Anti-NMDAR, к покровным слипам и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Через час обработайте образец 4% формальдегидом и PBS в качестве раствора для фиксации при комнатной температуре в течение пяти минут.
Затем промывайте образец тяги PBS в течение пяти минут каждый, с последующим добавлением вторичного антитела козьего античеловека Alexa Fluor 488 в разведении от одного до 1000 в течение одного часа при комнатной температуре. Затем установите крышку, содержащую образец, с жидкой монтажной средой и аспирируйте оставшуюся жидкость. Визуализируйте нейроны с помощью флуоресцентной визуализации.
Для визуализации кальция используйте клетки in vitro от 14 до 18 дней, которые были выращены на покровных листах. Перед визуализацией обработайте клетки вирусным вектором, кодирующим pAAV2 CAG GCaMP 5G в 2,5 раза по 10-10 копий генома на миллилитр в течение пяти-семи дней. За день до визуализации инкубируйте клетки с образцом пациента в течение 24 часов.
В день визуализации подготовьте установку и установите камеру клетки микроскопа на 37 градусов по Цельсию. Заполните дорожку дистиллированной водой, наполните ее 5% углекислым газом для поддержания физиологических условий клеток. После покрытия клеток внеклеточным физиологическим раствором перенесите их в клеточную камеру микроскопа.
Добавьте 10 микромоляров NBQX для блокирования рецепторов AMPA и KA и визуализируйте реакцию рецептора NMDA. Получите фильм продолжительностью четыре минуты с кадрами, записанными каждые 100 миллисекунд. Вскоре после начала приобретения добавьте в блюдо стимулирующий раствор.
При стимуляции извлекали флуоресцентный сигнал с течением времени из культуры, инкубированной с контрольной и спинномозговой жидкостью пациента или образцами ликвора с помощью программного обеспечения для обработки, такого как Image J.It было замечено, что клетки в один день in vitro были равномерно распределены и прилипли к пластине с ламеллой, развивающейся вокруг тела клетки, и незначительными нейритами, начинающими расширяться. После нескольких дней в культуре нейриты простирались на небольшое расстояние, и клетки показали значительную поляризацию. Нейронная сеть продолжала расти и усложнялась.
Через 18 дней нейроны были зрелыми, взаимосвязанными и строили нейронную сеть. Репрезентные флуоресцентные изображения показывают зрелые нейроны через 18 дней с использованием селективных маркеров. Инкубация культур с образцами пациентов производила интенсивный флуоресцентный сигнал, поскольку он содержит аутоантителы, которые распознавали NMDA-рецептор, присутствующий на поверхности нейронов.
Напротив, контрольные образцы не производили флуоресцентного сигнала при введении в нейронные культуры. Применение NMDA увеличивало интенсивность флуоресценции, о чем свидетельствует изменение внутриклеточной зеленой флуоресценции. Когда применялся стимулятор, нейроны, обработанные контрольным образцом CSF, показали более высокую разницу в интенсивности флуоресценции, чем клетки, обработанные образцом CSF пациентов.
Выявление свойств и рассечение гиппокампа определяют чистоту культур. Агрегация клеток является ключевым фактором, особенно при использовании культур для целей визуализации. Кроме того, культивируемые нейроны гиппокампа могут быть использованы для идентификации новых антител и их целевых антигенов в сочетании с методами иммунопреципитации и масс-спектрометрии.
Эта методика позволила охарактеризовать новую категорию заболеваний, опосредованных антителами. Поэтому он имеет важное значение при изучении новой области наноиммунологии.
