Этот протокол является полезным подходом для изоляции вирусов, ассоциированных с комарами, и может помочь в дальнейших исследованиях распространения патогенов, связанных с комарами, и борьбы с болезнями, переносимыми комарами. Использование тонких линий для выделения вирусов в лаборатории уровня биобезопасности 2 безопаснее и эффективнее. В отличие от других процедур выделения вируса, таких как циклическая красная инокуляция с различной жидкостью, этот метод не требует экспериментов на животных или этической оценки.
Загрязнение образцов и взятие клеток во время инкубации может привести к провалу эксперимента. Следовательно, необходимо добавить в среду 2% пенициллина-стрептомицина-амфотерицина, чтобы предотвратить загрязнение. Начните с добавления трехмиллиметровых керамических шариков, 1,5 миллилитра среды RPMI с добавлением 2% раствора пенициллина-стрептомицина-амфотерицина B в двухмиллилитровую стерильную пробирку, помещенную на лед, а затем перенесите в нее 50 комаров.
Затем гомогенизируйте комаров с помощью низкотемпературного тканевого гомогенизатора, измельчая в течение 30 секунд при частоте 70 герц и 4 градусах Цельсия в течение 3 циклов. Центрифугируйте гомогенат при 15 000 G в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия и перенесите надосадочные жидкости в новые пробирки. Чтобы полностью удалить остатки комаров, снова центрифугируйте надосадочную жидкость при 15 000 G в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия.
Залейте 200 микролитров надосадочной жидкости P0 в двухмиллилитровую пробирку с завинчивающейся крышкой и храните ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для амплификации вируса используйте клеточную линию C6/36 комаров с дефицитом РНКи Aedes albopictus и клеточную линию позвоночных, почку детеныша хомяка или BHK-21 из 75-сантиметровой квадратной колбы и посейте их в 24-луночные пластины отдельно. Поместите посеянную тарелку с 24 лунками на ночь при температуре 28 или 37 градусов по Цельсию.
На следующий день наблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы подтвердить от 80 до 90% слияния в каждой лунке. Приготовьте 500 миллилитров среды для поддержания клеточной культуры с добавлением антибиотиков. Извлеките питательную среду из 24 луночных планшетов и добавьте 100 микролитров среды для поддержания клеточных культур в каждую лунку.
Затем инокулируйте клетки 100 микролитрами надосадочной жидкости гомогената комара или P0. Инкубируйте пластины при температуре 28 или 37 градусов Цельсия в течение 60 минут и осторожно встряхивайте пластины каждые 15 минут, чтобы предотвратить высыхание клеток. После этого удалите надосадочную жидкость и промойте каждую лунку 600 микролитрами среды для поддержания клеточных культур, чтобы полностью удалить мусор. Затем добавьте 800 микролитров среды для поддержания клеточных культур в каждую лунку, прежде чем поместить планшеты в 5%-ный инкубатор, увлажненный углекислым газом, при температуре 28 или 37 градусов Цельсия в течение 7 дней.
Ежедневно контролируйте состояние клеток каждой лунки под микроскопом. На седьмой день соберите надосадочную жидкость клеток, известную как P1, и храните ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Повторите процедуру, чтобы собрать вирусные супернатанты P2 и P3.
Из-за цитопатогенного эффекта, или CPE, клетки из некоторых лунок погибают и отделяются от поверхности. Чтобы значительно усилить вирусы, соберите от 300 до 400 микролитров надосадочной жидкости из лунок, демонстрирующих эффект CPE, и перенесите ее в новую шестилуночную пластину, имеющую от 80 до 90% слияния клеток культуры. Наконец, соберите и перенесите 500 микролитров надосадочной жидкости из лунок шестилуночной пластины в двухмиллилитровые резервуары для хранения с завинчивающейся крышкой, прежде чем хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Инокуляция клеток C6/36 гомогенатами комаров P0 показала широкое межклеточное пространство в отслоившихся клетках через 120 часов после инфицирования по сравнению с неинокулированными или контрольными клетками. Инкубация клеток BHK21 с вирусными супернатантами P3 продемонстрировала видимый CPE через 48 часов после заражения, демонстрируя гибель клетки и отрыв от поверхности в отличие от контрольных клеток. Коммерчески доступные универсальные праймеры или флавивирусы, альфавирусы и буньявирусы использовались для получения продуктов ПЦР для вирусной надосадочной жидкости.
Продукт ПЦР для вируса Бунья, вируса озера Эбинур, был установлен в качестве положительного контроля. Запреты на амплификацию ПЦР в полосах, принадлежащих Bunyaviruses, и положительный контроль выявили возможность присутствия Bunyavirus в надосадочных продуктах. Чтобы повысить вероятность успешного выделения вируса, поддерживайте низкую температуру во время транспортировки, выделения и измельчения образцов.
Добавляют антибиотики при гомогенизации комаров и самой культуры. И быстро обрабатывайте культуру во время инкубации и удаления питательной среды. В дополнение к этой процедуре измельчающий раствор может быть введен в зародыш велосипедистой крысы или курицы.
Однако процедура подтверждения вызовет этические проблемы и увеличит расходы на эксперимент.
