Este protocolo é uma abordagem útil para o isolamento de vírus associados a mosquitos e pode ajudar em futuras pesquisas sobre a distribuição de patógenos relacionados a mosquitos e o controle de doenças transmitidas por mosquitos. Usar linhas finas para isolar vírus em laboratório de nível 2 de biossegurança é mais seguro e eficiente. Ao contrário de outros procedimentos de isolamento do vírus, como a inoculação ciclável vermelha com fluido variável, esta técnica não requer experimentação animal ou avaliação ética.
A contaminação das amostras e da retirada das células durante a incubação pode levar ao fracasso do experimento. Assim, é necessário adicionar 2% Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina no meio para evitar contaminação. Comece com a adição de esferas cerâmicas de três milímetros, 1,5 mililitros de meio RPMI suplementado com solução de 2% de penicilina-estreptomicina-anfotericina B em um tubo estéril de dois mililitros colocado no gelo e, em seguida, transfira 50 mosquitos nele.
Em seguida, homogeneizar os mosquitos com um homogeneizador de tecido a baixa temperatura, triturando por 30 segundos a 70 hertz e 4 graus Celsius por 3 ciclos. Centrifugar o homogeneizado a 15.000 G por 30 minutos a 4 graus Celsius e transferir os sobrenadantes para os novos tubos. Para remover os detritos do mosquito completamente, centrifugar o sobrenadante novamente a 15.000 G por 10 minutos a 4 graus Celsius.
Aliquot os 200 microlitros de sobrenadante P0 em um tubo de armazenamento de tampa de rosca de dois mililitros, e armazená-lo a menos 80 graus Celsius. Para a amplificação do vírus, use a linhagem C6/36 de células de mosquito Deficiente em RNAi de Aedes albopictus e uma linhagem de células de vertebrados, rim de hamster bebê ou BHK-21 de um frasco quadrado de 75 centímetros e semeá-los em placas de 24 poços separadamente. Coloque a placa de 24 poços semeada durante a noite a 28 ou 37 graus Celsius.
No dia seguinte, observe as células ao microscópio para confirmar 80 a 90% de confluência em cada poço. Preparar 500 mililitros do meio de manutenção de cultura celular suplementado com antibióticos. Retirar o meio de cultura celular das placas de 24 poços e adicionar 100 microlitros do meio de manutenção de cultura celular a cada poço.
Em seguida, inocular as células com 100 microlitros do sobrenadante do homogeneizado do mosquito ou P0. Incubar as placas a 28 ou 37 graus Celsius por 60 minutos e agitar suavemente as placas a cada 15 minutos para evitar o ressecamento das células. Uma vez feito, remova o sobrenadante e enxágue cada poço com 600 microlitros de meio de manutenção de cultura celular para remover os detritos completamente. Em seguida, adicione 800 microlitros de meio de manutenção de cultura celular a cada poço antes de colocar as placas em uma incubadora umidificada de dióxido de carbono a 5% a 28 ou 37 graus Celsius por 7 dias.
Monitorar diariamente o estado das células de cada poço sob o microscópio. No sétimo dia, colete o sobrenadante das células conhecidas como P1 e armazene-o a 80 graus Celsius negativos. Repita o procedimento para coletar sobrenadantes virais P2 e P3.
Devido ao efeito citopatogênico, ou CPE, as células de alguns dos poços morrem e se desprendem da superfície. Para amplificar grandemente os vírus: Coletar 300 a 400 microlitros do sobrenadante de poços mostrando o efeito CPE e transferi-lo para uma nova placa de seis poços com 80 a 90% de confluência celular de células de cultura. Finalmente, colete e transfira 500 microlitros do sobrenadante dos poços da placa de seis poços para tubos de armazenamento de tampa de rosca de dois mililitros antes de armazená-los a 80 graus Celsius negativos.
A inoculação de células C6/36 com os homogeneizados de mosquito P0 exibiu um amplo espaço intercelular nas células esfoliadas no período de 120 horas pós-infecção em comparação com as células não inoculadas ou controle. A incubação das células BHK21 com o sobrenadante viral P3 demonstrou um ECP visível em 48 horas pós-infecção, mostrando a morte da célula e descolamento da superfície em contraste com as células controle. Iniciadores universais comercialmente disponíveis ou Flavivírus, Alphavírus e Bunyavírus foram usados para gerar os produtos de PCR para o sobrenadante viral.
Um produto de PCR para o Bunyavirus, Ebinur Lake virus, foi definido como um controle positivo. A proibição de amplificação por PCR em pistas pertencentes a Bunyavirus e o controle positivo destacaram a possibilidade da presença de Bunyavirus nos sobrenadantes. Para melhorar a taxa de sucesso do isolamento do vírus, mantenha uma temperatura baixa durante o transporte, isolamento e moagem da amostra.
Adicione antibióticos ao homogeneizar os mosquitos e a própria cultura. E manusear a cultura rapidamente durante a incubação e a remoção do meio de cultura. Além deste procedimento, a solução de moagem pode ser injetada em um embrião de rato ou galinha.
No entanto, o procedimento de afirmação levantará preocupações éticas e aumentará o custo do experimento.
