Bu protokol, sivrisineklerle ilişkili virüsleri izole etmek için yararlı bir yaklaşımdır ve sivrisineklerle ilgili patojenlerin dağılımı ve sivrisinek tarafından taşınan hastalıkların kontrolü konusunda daha fazla araştırmaya yardımcı olabilir. Biyogüvenlik seviye 2 laboratuvarında virüsleri izole etmek için ince çizgiler kullanmak daha güvenli ve daha verimlidir. Kırmızı aşılamayı değişen sıvı ile döngülemek gibi diğer virüs izolasyon prosedürlerinin aksine, bu teknik hayvan deneyleri veya etik değerlendirme gerektirmez.
Numunelerden ve inkübasyon sırasında çizilen hücrelerden kaynaklanan kontaminasyon, deneyin başarısızlığına neden olabilir. Bu nedenle, kontaminasyonu önlemek için ortama% 2 Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin ilave etmek gerekir. Üç milimetrelik seramik boncukların, buzun üzerine yerleştirilmiş iki mililitrelik steril bir tüpe % 2 Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin B Çözeltisi ile desteklenmiş 1.5 mililitre RPMI ortamının eklenmesiyle başlayın ve ardından içine 50 sivrisinek aktarın.
Daha sonra, sivrisinekleri düşük sıcaklıklı bir doku homojenizatörü ile 70 hertz'de 30 saniye ve 3 döngü boyunca 4 santigrat derecede öğüterek homojenize edin. Homojenatı 15.000 G'de 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantları yeni tüplere aktarın. Sivrisinek kalıntılarını tamamen çıkarmak için, süpernatantı 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 15.000 G'de tekrar santrifüj edin.
200 mikrolitre süpernatant P0'ı iki mililitrelik bir vidalı kapak depolama tüpüne alın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Virüs amplifikasyonu için, Aedes albopictus RNAi eksikliği olan sivrisinek hücre hattı C6/36 ve omurgalı hücre hattı, bebek hamster böbreği veya BHK-21'i 75 santimetrekarelik bir şişeden kullanın ve bunları ayrı ayrı 24 kuyucuk plakasına yerleştirin. Tohumlanmış 24 kuyu plakasını gece boyunca 28 veya 37 santigrat dereceye yerleştirin.
Ertesi gün, her bir kuyucukta% 80 ila% 90 akıcılığı doğrulamak için mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin. Antibiyotiklerle desteklenmiş 500 mililitre hücre kültürü bakım ortamı hazırlayın. Hücre kültürü ortamını 24 kuyucuk plakasından çıkarın ve her bir kuyucuğa 100 mikrolitre hücre kültürü bakım ortamı ekleyin.
Daha sonra hücreleri sivrisinek homojenatının veya P0'ın süpernatantının 100 mikrolitresi ile aşılayın. Plakaları 60 dakika boyunca 28 veya 37 santigrat derecede inkübe edin ve hücrelerin kurumasını önlemek için her 15 dakikada bir plakaları hafifçe sallayın. Tamamlandığında, süpernatantı çıkarın ve kalıntıları tamamen gidermek için her bir kuyucuğu 600 mikrolitre hücre kültürü bakım ortamı ile durulayın. Daha sonra, plakaları 7 gün boyunca 28 veya 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirmeden önce her bir oyuğa 800 mikrolitre hücre kültürü bakım ortamı ekleyin.
Günlük olarak mikroskop altında her bir kuyucuğun hücrelerinin durumunu izleyin. Yedinci günde, P1 olarak bilinen hücrelerin süpernatantını toplayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. P2 ve P3 viral süpernatantları toplamak için prosedürü tekrarlayın.
Sitopatojenik etki veya CPE nedeniyle, bazı kuyucuklardan hücreler ölür ve yüzeyden ayrılır. Virüsleri büyük ölçüde büyütmek için: CPE etkisini gösteren kuyucuklardan 300 ila 400 mikrolitre süpernatant toplayın ve kültür hücrelerinin% 80 ila% 90 hücre akıcılığına sahip yeni bir altı delikli plakaya aktarın. Son olarak, eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce, altı delikli plakanın kuyucuklarından 500 mikrolitre süpernatant toplayın ve iki mililitrelik vidalı kapak depolama tüplerine aktarın.
C6/36 hücrelerinin sivrisinek homojenatları P0 ile aşılanması, aşılanmamış veya kontrol hücrelerine kıyasla, enfeksiyondan 120 saat sonra pul pul dökülmüş hücrelerde geniş bir hücreler arası boşluk sergilemiştir. BHK21 hücrelerinin P3 viral süpernatantlarla inkübasyonu, enfeksiyondan 48 saat sonra görünür bir CPE gösterdi ve kontrol hücrelerinin aksine hücrenin ölümünü ve yüzeyden ayrılmasını gösterdi. Ticari olarak temin edilebilen evrensel primerler veya Flavivirüsler, Alfavirüsler ve Bunyavirüsler, viral süpernatan için PCR ürünlerini üretmek için kullanılmıştır.
Bunyavirüs için bir PCR ürünü olan Ebinur Lake virüsü, pozitif bir kontrol olarak ayarlandı. Bunyavirüslere ait şeritlerde PCR amplifikasyon yasakları ve pozitif kontrol, süpernatantlarda Bunyavirüs varlığının olasılığını vurguladı. Virüs izolasyonunun başarı oranını artırmak için numune taşıma, izolasyon ve öğütme sırasında sıcaklığı düşük tutun.
Sivrisinekleri ve kültürün kendisini homojenize ederken antibiyotik ekleyin. Ve inkübasyon sırasında kültürü hızlı bir şekilde ele alın ve kültür ortamını kaldırın. Bu prosedüre ek olarak, öğütme çözeltisi bir döngüsel sıçan veya tavuk embriyosuna enjekte edilebilir.
Bununla birlikte, onaylama prosedürü etik kaygıları artıracak ve deneyin maliyetini artıracaktır.
