Наш метод позволяет измерить склонность к кальцификации образцов пациентов с использованием гладкомышечных клеток сосудов человека. Это поможет продвинуть исследования нарушений кальцификации сосудов, помогая в разработке новых методов лечения. Этот метод использует флуоресцентное обнаружение, которое повышает чувствительность и позволяет измерять образцы с течением времени, тем самым уменьшая потребность в репликациях и повышая надежность.
Для начала культивируйте клетки гладкой мускулатуры сосудов человека на колбах без покрытия клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Расщепление клеток при достижении 70-90% конфлюентности. Чтобы разделить, дважды промыте HVSMC с помощью PBS.
Добавьте трипсин и инкубируйте в течение 2-5 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Ингибировать трипсиновую реакцию путем добавления сыворотки, содержащей среду. Центрифугируйте ячейки в течение 4 минут при 350 RCF и повторно суспендируйте гранулу в поддерживающей среде.
После подготовки клеток к расщеплению, как показано, подсчитайте и посейте клетки в 48-луночную пластину, чтобы начать эксперимент по кальцификации. После ночной инкубации при температуре 37 градусов цельсия с 5% углекислым газом осторожно промыть клетки дважды PBS, тщательно аспирируя все оставшиеся PBS после второй промывки. Осторожно добавьте кальцификационную среду и далее инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом.
Проверяйте ежедневно со световым микроскопом, пока не произойдет кальцификация. Чтобы обнаружить кальцификацию с помощью визуализации, откройте программное обеспечение и выберите Протоколы и Создать новые. Выберите Процедура и нажмите Установить температуру.
Установите температуру на 37 градусов Цельсия и градиент на 1 градус Цельсия во всплывающем окне и нажмите OK. Выберите тип пластины в раскрывающемся меню. Добавьте шаг создания образа, щелкнув Изображение. Выберите инвертированный тепловизор и нажмите кнопку «ОК». Добавьте три канала обработки изображений и задайте для них dapi, RFP и Bright Field.
Установите флажок Монтаж и задайте нужное количество и расположение изображений. Измените перекрытие, чтобы представить лучшее покрытие каждой скважины. Выберите, какие скважины должны быть изображены.
Откроется новое окно, в котором можно выбрать интересующие скважины. Нажмите кнопку Параметры фокусировки, чтобы задать режим фокусировки. Откроется новое окно.
Установите каждый канал индивидуально. Как правило, скважины автоматически фокусируются на канале DAPI. Установите для всех остальных каналов значение Фиксированная фокусная высота от первого канала и установите его, нажав кнопку ОК. Закройте окно.
Начните шаги по предварительному сокращению данных, щелкнув Сокращение данных и выбрав Предварительная обработка изображений. Примите параметры по умолчанию, нажав кнопку ОК. Настройте шаг для подсчета клеток, выбрав Клеточный анализ. Выберите TsF DAPI Images в раскрывающемся меню канала.
Установите дополнительные сведения после выполнения визуализации. Подготовьте анализ сигнала RFP, выбрав Статистика во всплывающем окне Шаг Метка и выберите TsF RFP в качестве входного канала. Установите флажки Верхнее значение и Нижнее значение.
Установите флажок Общая площадь в нижнем списке. Выберите «Нет» в столбце «Цветовой эффект». Во всплывающем окне нажмите кнопку Пользовательский и установите флажок Фон.
Нажмите OK. Для справедливого считывания нормализуйте сигнал RFP на ячейку, нажав Ratio с левой стороны. Во всплывающем окне выберите Общая площадь количественной оценки RFP. Для параметра Ввод данных 1 в раскрывающемся меню выберите Количество ячеек в качестве входных данных 2.
Наконец, выберите Новое имя набора данных и дважды нажмите OK. Выберите Цветовой эффект, как показано ранее, и щелкните OK.In левом верхнем углу, выберите Файл и сохраните файл как тип файла протокола. Записывайте наблюдения за каждой временной точкой после первого случая кальцификации.
Нажмите «Читать сейчас» в программном обеспечении запуска и нажмите «Существующий протокол». Выберите протокол, созданный на предыдущем шаге. Программа предложит сохранить эксперимент.
Это можно сделать на этом этапе или позже вручную, нажав кнопку Сохранить в левом верхнем углу. Всплывающее окно попросит подождать, пока система нагреется. Включите контроллер углекислого газа и установите его на 5%Как только система достигнет заданной температуры, появится подсказка для вставки пластины и чтения.
Нажмите кнопку Отмена. Транспортировка пластины из инкубатора в тепловизор в сейфе, чтобы избежать поломки и разлива, и соответствует местным правилам биобезопасности для транспортировки живых клеток в случае аварии. Поместите пластину в устройство считывания пластин.
Нажмите на Процедура. Во всплывающем окне выберите Предустановленный шаг создания образа. Сначала настройте фокус и экспозицию на канале DAPI.
Снимите флажок Автоматическая экспозиция на всех каналах, затем щелкните значок микроскопа рядом с каналом DAPI. Откроется новое окно. Выберите колодец, чтобы направить фокус.
Если сигнал уже виден, сначала нажмите кнопку Автофокусировка, а затем Автоэкспозиция. Если нет, сначала увеличьте экспозицию и повторите автофокус и автоэкспозицию. Экспозицию можно настроить вручную, выбрав раскрывающееся меню Экспозиция.
Проверьте настройки на нескольких скважинах, затем сохраните настройки. Отрегулируйте экспозицию одинаково для всех каналов. Для канала RFP обязательно начните с колодца со средним и высоким кальцификацией.
Закройте окно процедуры и нажмите зеленую кнопку «Прочитать сейчас» на верхней панели задач. Сохраните эксперимент, как указано программным обеспечением. Повторите этот процесс для каждой точки времени.
Пока система считывает пластину, все изображения автоматически обрабатываются в фоновом режиме. Настройте параметры количества ячеек, выбрав изображения TsF DAPI для отображения. Выберите нужный колодец двойным щелчком мыши.
Появится новое окно. Выберите одно из изображений. Выберите вкладку Анализ во всплывающем окне.
Выберите Количество ячеек клеточного анализа и нажмите кнопку ОК. Отмените выбор каналов RFP и Bright Field. Установите флажок Выделить объекты. Нажмите кнопку Параметры, чтобы открыть меню.
Отрегулируйте порог размера и интенсивности, чтобы включить все ядра, но исключить мусор, а затем нажмите кнопку «ОК». Нажмите Применить изменения в левом нижнем углу, чтобы применить настройки ко всем изображениям. Аналогичным образом выберите хорошо выполненное изображение со средним и высоким уровнем кальцификации. Чтобы наилучшим образом настроить отношение сигнал/шум, перейдите на вкладку Анализ в меню Задача.
Выберите Статистика изображений. Снимите флажки DAPI и канала Bright Field. Нажмите кнопку Параметры, чтобы открыть меню.
Установите флажок Пороговые выбросы. Чтобы задать несубъективное пороговое значение для сигнала над фоном, выберите инструмент «Линия» на панели задач. Появится окно.
Проведите линию через участок сигнала, включив область фона. Отрегулируйте пороговые значения верхнего и нижнего значений. Только подсчитывайте сигнал над фоном и исключайте, есть ли обломки или артефакты.
Нажмите кнопку ОК и примените изменения, чтобы перенести настройки на все остальные скважины. Убедитесь, что порог точно выбран в других скважинах. После установки пороговых значений количества ячеек и RFP экспортируйте данные.
Нажмите кнопку Excel рядом с раскрывающимся меню, чтобы экспортировать данные непосредственно в электронную таблицу. Были обнаружены и проанализированы различные стадии кальцификации от низкой до высокой. Кальцификация была замечена в виде черных пятен с использованием световой микроскопии, которые были полезны для первичной оценки и определения того, когда начинать визуализацию.
Для улучшения отношения сигнал/шум обработанные изображения RFP были проанализированы для количественной оценки кальцификации. Данные были получены путем сравнения двух или более условий в один и тот же момент времени. Данные были нормализованы до количества клеток как площадь кальцификации на ячейку.
Данные также были изображены в виде временных рядов, показывающих одно и то же состояние в различные моменты времени. Важно, чтобы результаты после сокращения и анализа данных по-прежнему отражали то, что можно увидеть до преобразования изображения и порогового значения.
