私たちの方法は、ヒト血管平滑筋細胞を使用して患者サンプルの石灰化傾向を測定することを可能にします。これは、血管石灰化障害の研究を推進し、新しい治療法の開発を支援するのに役立ちます。この手法では、蛍光ベースの検出を使用して感度を高め、時間の経過とともにサンプルを測定できるため、反復の必要性が減り、堅牢性が向上します。
まず、コーティングされていない細胞培養フラスコ上でヒト血管平滑筋細胞を37°C、5%二酸化炭素で培養します。70〜90%のコンフルエンシーに達したら細胞を分割します。分割するには、HVSMCをPBSで2回洗浄します。
トリプシンを加え、摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。血清含有培地を添加することによりトリプシン反応を阻害する。細胞を350 RCFで4分間遠心分離し、ペレットを維持培地に再懸濁します。
実証されたように分割のために細胞を準備した後、細胞を数えて48ウェルプレートに播種し、石灰化実験を開始します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートした後、細胞をPBSで2回穏やかに洗浄し、2回目の洗浄後に残りのすべてのPBSを注意深く吸引します。石灰化培地を穏やかに加え、さらに摂氏37度で5%の二酸化炭素とインキュベートします。
石灰化が起こるまで光学顕微鏡で毎日チェックしてください。イメージングで石灰化を検出するには、ソフトウェアを開き、[プロトコル]と[新規作成]を選択します。[手順]を選択し、[温度の設定]をクリックします。
ポップアップウィンドウで温度を摂氏37度、勾配を摂氏1度に設定し、[OK]をクリックします。ドロップダウンメニューから選択したプレートタイプを選択します。[画像] をクリックして、イメージング ステップを追加します。反転イメージャーを選択し、「OK」をクリックします。3つのイメージングチャンネルを追加し、DAPI、RFP、および明視野に設定します。
[モンタージュ]ボックスにチェックマークを付けて、画像の目的の数と場所を設定します。[オーバーラップ] を変更して、各井戸のカバレッジを改善します。イメージングするウェルを選択します。
新しいウィンドウが開き、目的のウェルを選択できます。[フォーカスオプション]をクリックして、フォーカスモードを設定します。新しいウィンドウが開きます。
各チャンネルを個別に設定します。一般に、ウェルはDAPIチャネルに自動フォーカスされます。他のすべてのチャンネルを最初のチャンネルから固定焦点距離に設定し、「OK」をクリックして設定します。ウィンドウを閉じます。
[データ削減]をクリックしてプリセットデータ削減手順を開始し、[画像事前処理]を選択します。[OK] を選択して既定の設定をそのまま使用します。セルラー分析を選択して、細胞をカウントするステップを設定します。チャネル ドロップダウン メニューから [TsF DAPI イメージ] を選択します。
イメージングの実行後にさらに詳細を設定します。ポップアップウィンドウのラベルステップで統計を選択し、入力チャンネルとしてTsF RFPを選択して、RFP信号の分析を準備します。[上限値] ボックスと [下限値] ボックスにチェックマークを付けます。
下のリストの[総面積]チェックボックスをオンにします。[色の効果] 列で [なし] を選択します。ポップアップウィンドウで、[カスタム]をクリックし、[背景]ボックスにチェックマークを付けます。
OKを押します。公平に読み出すには、左側のRatioを押して、セルあたりのRFP信号を正規化します。ポップアップウィンドウで、RFP定量化総面積を選択します。ドロップダウン メニューから [データ入力 1] を選択し、[データ入力 2] として [セル数] を選択します。
最後に、新しいデータセット名を選択し、[OK]を2回押します。前に示したように [色の効果] を選択し、左上隅 OK.In をクリックして [ファイル] を選択し、ファイルをプロトコル ファイルの種類として保存します。石灰化の最初のインスタンスが発生した後のすべての時点の観測値を記録します。
スタートアップソフトウェアで[今すぐ読む]を押して、[既存のプロトコル]をクリックします。前の手順で作成したプロトコルを選択します。プログラムは、実験を保存するように求めます。
これは、この段階で行うことも、後で左上の[保存]ボタンをクリックして手動で行うこともできます。ポップアップウィンドウは、システムが加熱されるのを待つように求めます。二酸化炭素ガスコントローラーの電源を入れてに設定します 5%システムが設定温度に達すると、プレートを挿入して読み取るように求めるプロンプトが表示されます。
キャンセルを押します。プレートをインキュベーターからイメージャーに安全な箱に入れて輸送し、破損やこぼれを防ぎ、事故が発生した場合に生細胞を輸送するための地域のバイオセーフティ規制に準拠しています。プレートをプレートリーダーに入れます。
[手順]をクリックします。ポップアップウィンドウで、[プリセットイメージングステップ]を選択します。最初に DAPI チャネルのフォーカスと露出を調整します。
すべてのチャンネルで自動露出ボックスのチェックを外し、DAPIチャンネルの横にある顕微鏡アイコンをクリックします。新しいウィンドウが開きます。フォーカスを向けるウェルを選択します。
信号がすでに表示されている場合は、まず「オートフォーカス」をクリックし、次に「自動露出」をクリックします。そうでない場合は、最初に露出を上げて、オートフォーカスと自動露出を繰り返します。露出は、[露出]ドロップダウンメニューを選択して手動で調整できます。
複数のウェルの設定を確認し、設定を保存します。すべてのチャンネルで同じ方法で露出を調整します。RFPチャネルの場合は、中程度から高い石灰化のある井戸から始めてください。
手順ウィンドウを閉じ、上部のタスクバーにある緑色の[今すぐ読む]ボタンを選択します。ソフトウェアで示されているように実験を保存します。各時点について、このプロセスを繰り返します。
システムがプレートを読み取る間、すべての画像はバックグラウンドで自動的に処理されます。表示する TsF DAPI 画像を選択して、セル数の設定を調整します。ダブルクリックして目的のウェルを選択します。
新しいウィンドウがポップアップします。いずれかの画像を選択します。ポップアップ ウィンドウで [分析] タブを選択します。
「セルラー分析セル数」を選択し、「OK」をクリックします。RFP チャンネルと明視野チャンネルの選択を解除します。[ハイライトオブジェクト]ボックスにチェックマークを付けます。[オプション] をクリックしてメニューを開きます。
[サイズ]と[強度のしきい値]を調整して、すべての核を含め、破片を除外し、[OK]をクリックします。左下の[変更を適用]をクリックして、すべての画像に設定を適用します。同様に、石灰化が中程度から多いウェルエンド画像を選択します。信号対雑音比を最適に調整するには、[タスク]メニューの[解析]タブをクリックします。
[画像の統計情報] を選択します。DAPI およびブライトフィールドチャンネルの選択を解除します。[オプション] をクリックしてメニューを開きます。
[しきい値の外れ値] ボックスにチェックを入れます。背景より上の信号の非主観的なしきい値を設定するには、タスクバーからラインツールを選択します。ウィンドウがポップアップします。
背景の領域を含めながら、信号のパッチに線を引きます。しきい値の上限と下限を調整します。バックグラウンドより上の信号のみをカウントし、破片やアーティファクトがある場合は除外します。
[OK]をクリックして変更を適用し、設定を他のすべてのウェルに転送します。他のウェルで閾値が正確に選択されていることを確認します。セル数と RFP しきい値を設定したら、データをエクスポートします。
ドロップダウン メニューの横にある [Excel] ボタンをクリックして、データをスプレッドシートに直接エクスポートします。低から高までのさまざまな石灰化段階が検出され、分析されました。石灰化は光学顕微鏡を使用して黒い斑点として発見され、一次評価とイメージングを開始する時期の決定に役立ちました。
改善された信号対雑音比のために、処理されたRFP画像を分析して石灰化を定量化しました。データは、2つ以上の条件を同時に比較することによって得られた。データは、細胞当たりの石灰化面積として細胞数に対して正規化した。
データは、さまざまな時点で同じ状態を示す時系列としても描かれました。データの削減と分析の結果は、画像の変換としきい値設定の前に見ることができるものを反映していることが重要です。
