Рак молочной железы является распространенным и смертельным заболеванием с ограниченными стратегиями профилактики, которые сопровождаются серьезными негативными побочными эффектами. Чтобы обеспечить метод с уменьшением побочных эффектов, мы разработали технику внутрипротоковой инъекции абляционного раствора на основе этанола в дерево протоков молочной железы крысы, которая позволяет одновременно проводить визуализацию in vivo и профилактику рака молочной железы. Это основано на предыдущей работе у мышей, у которых инъекция непосредственно в отверстие соска позволяет нацеливаться на эпителиальные клетки молочной железы с минимальным повреждением коллатеральной ткани.
И мыши, и крысы имеют молочные железы, содержащие одно проточное дерево, происходящее из отверстия соска. Крысы крупнее мышей и позволяют вводить больший объем этанола для изучения успеха абляции, чтобы доказать масштабируемость модели. Еще одним усовершенствованием этого метода является добавление этилцеллюлозы к абляционному раствору.
Этилцеллюлоза ранее использовалась в других клинических подходах для уменьшения распространения этанола за пределами области, на которую нацелена цель. Это достигается за счет природы соединения, которое заставляет его гель при контакте с жидкостью в ткани. Есть пять ключевых шагов, связанных с этим методом проверки рака молочной железы.
Сначала мы должны начать дозировать животным карпрофен перорально, используя чашки с сукралозным гелем, приготовленные в лаборатории. Это расширенное противовоспалительное лечение поддерживается до и после процедурно. Далее мы удаляем шерсть из области, окружающей соски, чтобы ввести крем для депиляции, чтобы подготовить животное к инъекциям.
Внутрипротоковые инъекции затем выполняются с помощью стереоскопа, помогающего визуализировать отверстие соска для введения иглы. Животные сканируются или оцениваются с помощью микроКТ или рентгеноскопии после инъекции, чтобы определить успех инъекций. Затем сканирование микроКТ может быть обработано для создания 3D-реконструкций введенного дерева протоков молочной железы для дальнейшего анализа успешного наполнения.
Стоковый карпрофен сначала разбавляют в ПВС до необходимой концентрации. Стерильный пищевой краситель может быть добавлен в смесь, чтобы лучше подтвердить полное смешивание препарата с сукралозой чашки. Затем чашки нагревают на водяной бане при температуре 60 градусов Цельсия в течение 15 минут.
Сушка чашек при снятии и очистка крышки чашки 70% этанолом снижает риск загрязнения. Раствор карпрофена можно вводить непосредственно в чашку с помощью шприца для прокалывания крышки. В этом случае нам нужно ввести 500 микролитров для желаемого результата.
Закройте отверстие наклейкой, прежде чем встряхнуть чашку в течение 15 секунд, а затем вихрь в течение дополнительных 15 секунд. Однородное перемешивание можно оценить, ища скопления темно-синего цвета. Затем чашки можно хранить в холодильнике до тех пор, пока это не понадобится.
Животные должны быть подготовлены за два-три дня до инъекций. Обезболить животное с помощью ингалятора изофлурана. Перенесите анестезированную крысу в носовой конус на согревающей прокладке.
Нанесите глазную смазку на крысу, находясь у конуса носа, а затем поместите животное на спину. Крем для депиляции можно наносить на область сосков, которые вы планируете вводить с помощью аппликатора с хлопковым наконечником. Более быстрого ослабления меха можно достичь, втирая аппликатор вверх и вниз по коже животного в нужной области.
Важно оставить крем на крысе как можно меньше времени, чтобы избежать ожога кожи. Крысы даже более чувствительны, чем мыши, к этой процедуре. После 10-30 секунд нанесения используйте теплую воду на марле, чтобы полностью удалить крем.
Используйте три-четыре полоскания, чтобы обеспечить полное удаление перед сушкой кожи чистой марлей. Подтверждают хорошую видимость и доступ к соскам в зонах удаления меха. При необходимости повторите процедуру депиляции.
Поместите крысу в чистую клетку для восстановления на согревающей подушке, чтобы восстановиться после анестезии. Дайте одну чашку карпрофена подготовленным крысам в их домашней клетке после выздоровления. Вы начнете с обезболивания животного с помощью ингаляционной изофлурановой анестезии и переместите крысу к конусу носа, как только он будет полностью индуцирован.
Смазку для глаз следует наносить перед тем, как положить животное на спину для инъекций. Может быть полезно заклеить ноги рядом с сосками, которые будут введены, но не нужны. После того, как вы подготовили шприц с желаемым объемом инъекционного раствора, подготовьте сосок, удалив любую видимую мертвую кожу, используя щипцы с мелкими наконечниками, если это возможно.
Наиболее распространенной областью беспокойства является само отверстие соска. У крыс часто есть пробка, выступающая из отверстия. Удаление этой пробки может помочь в лучшей канюляции.
Когда виден скос иглы, вставьте иглу в кончик соска с помощью щипцов с тонкими наконечниками. Следите за тем, чтобы следовать по пути отверстия соска. Соски крыс, как правило, имеют больше жира, окружающего отверстие, что облегчает прокалывание в этот жир, и ошибочно полагают, что вы достигли канюляции из-за продвижения иглы.
Как только скос иглы будет полностью окружен соском, начните медленно вводить раствор. Желаемая скорость составляет примерно 100 микролитров в минуту у крыс. Избегайте инъекций быстрее, чем это, чтобы предотвратить возможное повреждение протокового дерева.
После полной инъекции подождите 30 секунд, прежде чем вынуть иглу из соска с помощью щипцов. Это уменьшит вероятность утечки из соска. Если утечка все-таки произошла, используйте смачиваемую марлю или салфетку с этанолом, чтобы очистить раствор.
Контраст и пролитый раствор могут искажать полученные изображения. Здесь мы видим увеличенное видео последовательности инъекций, которая только что была отображена. Обратите внимание, что дыхание животного затрудняет удержание соска в одной фокальной плоскости.
Это может затруднить инъекцию, так как сосок не остается в постоянном месте. Эта проблема усугубляется близостью к грудной клетке и трем верхним парам желез. Заглушка в отверстии ниппеля теперь удалена для лучшей канюляции.
Игла теперь может быть ориентирована на скос вверх, чтобы быть выдвинутой в сосок с помощью щипцов. Как только скос будет полностью вставлен, может начаться инъекция. Если вы внимательно посмотрите на левую сторону соска, вы можете заметить увеличение синего оттенка, где раствор для инъекций слегка виден, распространяясь по протоковому дереву.
Это гораздо менее заметно у крыс из-за более толстой кожи. Здесь мы можем видеть удаление иглы через 30 секунд после завершения инъекции и выплескивание полученного раствора из соска. Дополнительный раствор очищается, что позволяет оценить область, где мы не видим травмы соска или доминирования области, что указывает на инъекцию жировой подушки.
При введении раствора, содержащего этанол, необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать алкогольной интоксикации. Это требует знания того, сколько этанола может быть введено за один сеанс и введения раствора, содержащего сахарозу, ВО время процедуры для противодействия эффектам. После инъекции животные могут быть восстановлены в чистой клетке на грелке или перемещены в микроКТ для визуализации успеха инъекции.
После перемещения введенного животного к инструменту микроКТ продолжайте введение изофлурана для поддержания анестезии во время визуализации. Увеличенный размер крысы требует дополнительных манипуляций с положением для достижения хорошего изображения. Выпрямление позвоночника перед тем, как заклеить ноги рядом с участком, который будет изображен, полезно для создания последовательных изображений.
Тейпирование ног в вытянутом положении может помешать тому, чтобы кости стали фокусом изображения. Мы также обнаружили, что заклеивание по брюшной полости крысы может помочь в уменьшении дыхательного артефакта для нижних желез. Несколько параметров сканирования приемлемы для визуализации протоковой обработки.
Однако дозу облучения всегда следует учитывать при выборе параметров. Доза облучения, полученная в результате этих сканирований, не должна превышать пределы радиации для данного штамма крыс. Флюороскопический анализ, а не получение изображения, может значительно снизить общую радиационную нагрузку.
После того, как все сканирования или оценки были сделаны, животное может быть возвращено в чистую клетку восстановления на согревающей подушке. За животным следует следить до полного выздоровления и возвращать в домашнюю клетку. Чашки карпрофена должны быть предоставлены по крайней мере до семи дней после инъекции.
Программное обеспечение на используемом нами приборе microCT позволяет создавать быстрые представления для оценки успешности инъекции без формального анализа. Эта функция имеет простой контрастный ползунок, который обеспечивает разумное снижение сигнала к шуму. Основным недостатком этих представлений является то, что все изображение должно быть пороговым одновременно.
Это позволяет ярким сигналам, которые явно не являются частью протокового дерева, таким как железо в рационе, оставаться на изображении. В некоторых случаях истинный сигнал, как показано здесь, такой же тусклый, как фон, и может быть легко удален из изображения. Лучшие формальные представления могут быть сделаны с использованием более сложного аналитического программного обеспечения, которое позволяет сегментировать интересующую область.
Лучше всего сегментировать жировую прокладку молочной железы для дальнейшей обработки изображения, чтобы получить наилучшее представление введенного протокового дерева. Темная граница жировой подушечки молочной железы может быть прослежена по всей толщине животного, чтобы достичь этой сегментации. Трассировки каждого третьего среза и распространения объекта достаточно, чтобы захватить весь воздуховод в нашем опыте.
На этом этапе можно порог представления, используя заданную ярость, чтобы отобразить только контраст, содержащийся в жировой подушке молочной железы. Это должно включать раствор внутри протокового дерева, а также любую утечку в непосредственной близости. Растворы оксида тантала, как правило, хорошо отображаются в диапазоне от 300 до 3000 HU. Дальнейший анализ может быть сформирован после того, как вы создали реконструкцию протокового дерева.
Если продольная визуализация не желательна, могут быть получены изображения с более высоким разрешением, которые лучше отражают сложную архитектуру протокового дерева. Различия между животными могут сделать инъекцию более или менее сложной. Мы не можем говорить о изменчивости штамма к штамму, поскольку в настоящее время мы работаем исключительно с крысами Sprague Dawley.
Некоторые животные будут иметь соски с низким профилем, как тот, что изображен здесь, что затрудняет манипулирование и достижение успешной канюляции. У других будут соски с более высоким профилем, как тот, который показан здесь, который будет более поддающимся канюляции. Здесь изображен удачно канюлированный сосок.
Затруднение канюляции может привести к травме соска, как показано здесь. Получение микроКТ-изображений сразу после инъекции может лучше информировать исследователей об успехе инъекции, а также помочь определить пломбировочные свойства определенных растворов. Здесь мы видим различные аспекты работы брюшных желез одной и той же крысы, вводимой с одинаковым объемом абляционного раствора, содержащего 70% этанол с контрастом, обеспечиваемым 100 миллимолярным оксидом тантала.
Раствор, используемый в показанной верхней железе, также содержал 1% этилцеллюлозы. Мы видим стенообразные структуры на концах проточных ветвей. Это концевые почки, заполненные раствором и не разливающиеся.
В нижнем ряду мы видим менее определенные проточные концы, указывающие на выход раствора из протокового дерева. Это, наряду с более ограниченным побочным повреждением при гистологическом исследовании. по-видимому, указывает на лучшее удержание растворов, содержащих этилцеллюлозу, в протоковом дереве.
Этот метод обеспечивает шаг к масштабируемости менее инвазивного метода профилактики рака молочной железы, чтобы предложить альтернативу профилактической мастэктомии. Успешная эпителиальная абляция в более крупной модели грызунов была продемонстрирована с минимальными побочными эффектами для животного. Добавление этилцеллюлозы к абляционному раствору позволяет лучше удерживать раствор в области инъекции, что приводит к уменьшению сопутствующего ущерба.
Новое использование решений, которые были клинически доказаны, и дополнительная способность визуализировать успех доставки с помощью общих методов визуализации позволяет осуществлять готовый перевод в клинику.
