Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака о том, как микроокнония поддерживает рост опухоли или же конкретный препарат может эффективно препятствовать прогрессированию рака молочной железы. Основными преимуществами метода индукции опухоли являются то, что операция не требуется, и это менее инвазивным способом, с помощью которого установить рак молочной железы на месте. Используя этот метод, опухолевые клетки растут в молочной жировой площадке, в соответствующей среде ткани, имитируя прогрессирование рака молочной железы человека более тесно, чем подкожная инъекция или ксенотрансплантат для клеток мышей.
Ке-Синь Цао, наш техник, и я, поможет Ган-Лин Чжан в демонстрации этой процедуры. За день до операции вручную удерживайте мышь-получателя и поверните живот животное вверх к меху, чтобы побриться вокруг четвертых сосков. Протрите мех тонким слоем крема для депиля.
Используйте дистиллированную воду, чтобы удалить крем через 30-60 секунд и высушить мышь мягкими бумажными полотенцами. В день операции разбавляют суспензию раковых клеток молочной железы мурина до двух раз от десяти до пятых клеток на миллилитр концентрации PBS, в стерильной микроцентрифуге трубки на льду. Перед каждой инъекцией загрузите один, один миллилитрный шприц, оснащенный иглой 45 на 16, с 50 микролитров клеток на мышь.
И подтвердить отсутствие реакции на щипать ногой в каждом поделенное животное. Нанесите мазь на глаза животного и используйте пинцет, чтобы палатка кожи вокруг четвертого соска первой мыши, чтобы создать туннель для шприца следовать. Держите шприц с скошенной лицом вверх и подкожно введите кожу на 5 до 10 миллиметров от соска, после туннеля, пока кончик иглы почти не достигнет соска.
Использование пинцета для палатки кожи вокруг первого соска создает туннель для шприца следовать. Игла должна быть введена между кончиками пинцета и должны поднять вместо удручает в ткани. Тщательно переместите кончик иглы вверх в молочную жировую площадку до тех пор, пока скошен не будет под сосок, и отпустите палатку для кожи, чтобы позволить медленную инъекцию раковых клеток.
После вставки, осторожно переместить кончик иглы вверх в молочный жир площадку, пока скошен не находится под соском. И вы почувствуете устойчивость к обеспечению доставки ячеек в нужное место. Когда все клетки были введены, поверните иглу немного в сторону и медленно втягивать шприц.
Используйте ватный тампон, чтобы оказать давление на рану иглы в течение 10 до 20 секунд, чтобы не было просачивания жидкости. Вводимый сосок должен выглядеть как прозрачная, белая, плоская сфера, с соском в центре. Чтобы установить объем опухоли, сдерживайте сторону живота мыши вверх и используйте калипер для измерения длины и ширины опухоли.
Чтобы зафиксировать биолюминесценцию опухоли, за 10 минут до визуализации вводят 150 миллиграммов на килограмм D-люциферина в затылок мыши. И захват биолюминесценции изображения первичной опухоли и метастазы при соответствующих параметрах биолюминесценции изображения. В соответствующей экспериментальной точке времени, использовать ножницы для сбора опухоли из кожи.
И применить обезболивающие растворы для хирургического сайта, чтобы облегчить послеоперационную боль. Затем закройте кожу хирургическими швами в соответствии со стандартными протоколами. Позвольте животному восстановиться под разогрева лампой с мониторингом до полного выздоровления.
Используйте скальпель, чтобы разрезать первичную опухоль на две равные части. Храните половину ткани в 4%paraformaldehyde для последующего гематоксилина и эозина окрашивания и иммуногистохимии. Заморозить другую половину в жидком азоте для западной blotting или RNAi изоляции.
При соответствующем экспериментальном урожае конечных точек легкие в соответствии со стандартными протоколами вскрытия и мыть орган в PBS. Затем исправить легкие в 4%paraformaldehyde для проверки метастазов гематоксилина и эозина окрашивания. Рост первичной опухоли можно измерить по объему опухоли и биолюминесценции живых опухолевых клеток, как это было продемонстрировано.
Метастазы не наблюдаются на ранних стадиях прививки, так как либо не установлена вторичная опухоль, либо сильные биолюминесцентные сигналы первичной опухоли препятствуют обнаружению мелких метастатических очагов со слабыми сигналами. После ресекции можно обнаружить и проанализировать сигнал биолюминесценции от метастатического очага удаленных органов. Анализ морфологии как первичной опухоли молочной железы, так и легких с помощью гематоксилина и окрашивания эозинов показывает увеличение ангиогенеза в опухолевых клетках привитых животных, о чем свидетельствует окрашивание маркера микровесселя anti-CD31.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы убедиться, что кончик иглы находится в правильном месте перед доставкой опухолевых клеток. После этой процедуры, распылительы, как УЗИ животных, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о мочевого пузыря добавок первичной опухоли in vivo. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области опухолевых и разработки препарата в изучении ключевых факторов и путей, участвующих в tumorigenesis и механизмы противоопухохотных препаратов в моделях мурин животных.
Не забывайте, что работа с изофлюраном или другой газовой анестезией может быть чрезвычайно трудно доза и что меры предосторожности, такие как использование активированной углеродной маски, всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
