Этот метод использует ПЭТ-визуализацию для выяснения распределения и динамики В-клеток в центральной нервной системе in vivo. Наш подход полезен при изучении неврологических заболеваний, где пораженный спинной мозг затрудняет анализ. Таким образом, у нашей методики есть несколько основных преимуществ.
Во-первых, мы создали новый инструмент для отслеживания биомаркера пан-В-клеток, который позволяет нам захватывать ряд субпопуляций В-клеток и визуализировать их in vivo. Во-вторых, наш метод анализа спинного мозга позволяет проводить высокоточную и воспроизводимую количественную оценку сигналов ПЭТ в этой области. Самое замечательное в нашей методике то, что она не зависит от заболевания.
Он может быть использован как в доклинической, так и в клинической ПЭТ-визуализации в любом сценарии, где интерес представляют В-клетки и/или спинной мозг. Через 18–24 часа после радиоактивного мечения и введения антитела мыши подготовьте мышь к сканированию, нанеся на глаза глазной гель. Убедитесь, что сканирующая кровать для четырех мышей оснащена грелкой с изофлураном от 1,5 до 2%Поместите мышь в положение лежа на столе для сканирования и осторожно потяните за хвост мыши, чтобы выпрямить позвоночник.
Как только мышь окажется в положении лежа на спине, надежно заклейте ее мягкой лентой для микроскопа на голову и живот, чтобы свести к минимуму движение при дыхании. Запишите положение сканирования для каждой мыши в лабораторном блокноте. Закрепив первую группу, закройте кровать и проверьте расположение кровати с помощью компьютерной томографии.
Нажмите на CT Center Field of View и, как только кровать будет установлена на место, запустите тестовое сканирование КТ, чтобы убедиться в правильном размещении. Повторяйте до тех пор, пока положение кровати не станет удовлетворительным. Поместите маленькую белую ленту на станину сканера, чтобы отметить правильное расположение кровати до конца исследования.
Откройте меню «Контроллер движения» и нажмите «Поле зрения ПЭТ-центра», чтобы переместить мышей в кольцо ПЭТ. После того, как кровать окажется в ПЭТ-кольце, запустите последовательность сканирования, нажав «Выполнить», и подождите, пока сканер автоматически завершит ПЭТ-сканирование, и перейдите от ПЭТ-кольца к КТ для получения КТ. Поскольку экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, или ЭАЭ, у мышей наблюдается выраженное искривление позвоночника из-за прогрессирования заболевания, сканирование их в положении лежа на спине помогает выпрямить позвоночник.
Сделайте надрез на спинной стороне животного и снимите кожу и шерсть, чтобы обнажить позвоночный столб. Разрез по трем поперечным плоскостям через позвоночный столб у шеи, непосредственно под грудной клеткой и в верхней части таза, чтобы отделить поясничный отдел от шейного и грудного. Аккуратно удалите сегментированный позвоночный столб, чтобы получилось два куска, поясничный и шейно-грудной.
Затем изолируют поясничный отдел позвоночника, аккуратно обрезая позвоночный столб от тазового конца до тех пор, пока не станет виден поясничный отдел спинного мозга. Для изгнания из поясничного отдела спинного мозга используйте шприц со скользящим наконечником, наполненный PBS, и создайте уплотнение между шприцем и позвоночным столбом с помощью большого и указательного пальцев. Осторожно протолкните PBS через шприц, чтобы вытолкнуть спинной мозг на абсорбирующую прокладку, и повторите то же самое для шейного отдела грудного отдела спинного мозга, введя шприц с шейной стороны.
Поместите ткани спинного мозга в гамма-счетную трубку. Запишите сухой вес и добавьте PBS, чтобы убедиться, что ткань находится на дне пробирки, чтобы избежать высыхания. Положите трубку на лед до тех пор, пока она не будет готова к счету.
Чтобы начать анализ областей интереса в спинном мозге, откройте инструмент Область интереса 3D из меню Навигация. Под заголовком «Области интереса» используйте знак «плюс» в нижней части меню, чтобы создать шесть областей интереса: поясничную область интереса, шейно-грудную область интереса, поясничный скелет, грудной скелет, поясничный отдел спинного мозга, грудной отдел спинного мозга. Чтобы избежать визуальных помех от сигнала PET, нажмите F3, чтобы выключить PET.
Перейдите в верхнюю часть инструмента 3D Region of Interest Tool Operator и щёлкните по сплошной точке справа от символа курсора, чтобы открыть меню 3D Paint Mode and Erode/Dilate. Выберите «Сфера» и измените размер на 20 пикселей. Точно так же установите расширение на плюс пять.
Прежде чем продолжить, перейдите в нижнюю часть меню и убедитесь, что выбрана интересующая поясничная область. На КТ найдите L6 позвонок позвоночного столба. Начиная с одного позвонка выше L6, нарисуйте грубую поясничную область над пятью позвонками над бедрами.
Затем переключитесь на шейно-грудной отдел и проведите оставшуюся часть позвоночника до основания черепа. Нарисовав обобщенные области интереса, перейдите в верхнюю часть оператора и выберите меню Алгоритмы сегментации. В раскрывающемся меню выберите Otsu Thresholding, затем выберите интересующую поясничную область для ввода и убедитесь, что в нижней части меню выбран поясничный скелет.
В выпадающем меню рядом с пунктом Изображение убедитесь, что выбран снимок компьютерной томографии, обозначенный здесь цифрой ноль. Нажмите «Применить» и повторите процедуру для интересующего шейного отдела грудной клетки и грудного скелета. После использования инструмента «Пороговое значение Оцу» для создания областей интереса скелета вернитесь в меню «Навигация» и удалите интересующую область или установите флажок в столбце «H» для интересующих областей грубого поясничного отдела и шейно-грудного отдела, чтобы скрыть их.
Отметьте галочкой столбец I для обеих областей скелета, чтобы их нельзя было редактировать. Наконец, вернитесь в верхнюю часть инструмента 3D Region of Interest Tool Operator и перейдите в меню 3D Paint, чтобы нарисовать интересующие области спинного мозга. Снова выберите инструмент «Сфера» и обведите спинной мозг в скелете как для поясничного, так и для грудного отдела, убедившись, что в нижней части меню выбрана правильная область интереса.
Чтобы стереть любую интересующую область, нажмите Command/Control и нарисуйте деталь, которую нужно стереть. Проверьте интересующую область спинного мозга со всех трех плоскостей, чтобы убедиться, что ни одна интересующая область не выходит за пределы позвоночного столба. Если сигнал ПЭТ был выключен, нажмите клавишу F3 после того, как будут нарисованы интересующие области спинного мозга, чтобы снова включить ПЭТ, или выберите визуальный контроллер и нажмите на полосу ПЭТ.
Вернитесь в меню навигации. Нажмите на иконку сетки, чтобы отобразить таблицу. Скопируйте таблицу в программу для работы с электронными таблицами и сохраните файл.
ПЭТ-томография выявила повышенное связывание радиоактивных индикаторов в головном и грудном отделах спинного мозга мышей с ЭАЭ по сравнению с наивными мышами. Подсчет гамма-гамма ex vivo показал повышенное связывание как в поясничном, так и в шейном отделах грудного отдела позвоночника, а также в головном мозге мышей EAE по сравнению с наивными. Изображения ауторадографии ex vivo показали повышенное связывание радиоактивных индикаторов в сагиттальных отделах мозга, в частности, в стволе мозга, мозжечке и желудочках мышей с ЭАЭ по сравнению с наивными мышами.
Аналогичным образом, повышенное связывание с радиоактивными индикаторами наблюдалось как в шейном, грудном, так и в поясничном сегментах спинного мозга мышей EAE по сравнению с наивными спинными мозгами. После ПЭТ-визуализации и гамма-подсчета мы можем исследовать взаимосвязь между ПЭТ-сигналом и интересующей мишенью с помощью методов молекулярной биологии, таких как проточная цитометрия и иммуногистохимия. Наша методика проложила путь для исследователей, чтобы задавать вопросы о роли В-клеток in vivo во многих областях заболеваний, включая инсульт, рассеянный склероз, другие аутоиммунные заболевания и рак.
