Этот протокол может помочь понять механизмы, участвующие в регуляции KCC2, путем непосредственной оценки фосфорилирования молекулярного размера киназы, тем самым проливая свет на его физиологические функции и активность. Он может быть использован для идентификации и характеристики молекул, таких как белки, представляющие интерес из сложных смесей родственных молекул, даже если экспрессия белка очень незначительна. Этот метод является важным инструментом для анализа белка сложных систем и выявления потенциальных механизмов, лежащих в основе аберрантной функции тканей или заболевания.
Демонстрировать процедуры будет Сандей Соломон Джозайя, аспирант из моей лаборатории. Начните с предварительного вооружения всех реагентов в бисерной ванне 37 градусов по Цельсию и размораживания стабильно трансекированной крысы KCC2b эмбриональной почки человека 293 клетки полностью в бисерной ванне. Затем переместите клетки из криобазонной трубки в центрифужную трубку, содержащую пять миллилитров свежей среды, и центрифугируйте клетки при 1 200 г в течение трех-пяти минут.
После аспирации супернатанта с помощью аспираторной пипетки, закрепленной на вакуумном насосе, повторно суспендируют ячейки в 10 миллилитрах свежей среды. Переложите суспензию на 10-сантиметровую тарелку и дайте ей расти в течение 48 часов в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом. Как только клетки достигнут 90%-ной конфлюентности, разделите их, аспирируя старые носители и промывая их двумя миллилитрами PBS.
Добавьте два миллилитра трипсина и высиживайте их около одной-двух минут при комнатной температуре. Промыть трипсинизированные клетки, используя два миллилитра полной среды. Добавьте девять миллилитров свежей среды в новые блюда.
Затем добавьте один миллилитр раствора из старого блюда в новое блюдо. Переложите расщепленные ячейки чашки в инкубатор на 48 часов, чтобы достичь более 90% слияния. Обработайте клетки либо диметилсульфоксидом, либо восьмимиполярным ставроспорином, либо 0,5 миллимолярным N-этилмалеймидом в течение 15 минут перед сбором в буфере лизиса.
Аспирируйте среду из трансективной чашки, поместите посуду культуры на лед и вымойте клетки ледяным PBS. Аспирируйте PBS и добавьте в блюдо 1,0 миллилитра ледяного буфера лизиса. После соскабливания ячеек со дна тарелки с помощью холодного пластикового скребка переложите клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку, помещенную на лед, с последующим постоянным перемешиванием в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.
После центрифугирования клетки лизаты в холодной центрифуге поместите ее на лед. Соберите супернатант в предварительно охлажденную свежую трубку и выбросьте гранулу. Пипетка 300 микролитров белка G Сефароза в микроцентрифужную трубку.
Затем центрифугируют раствор при 500 Г в течение двух минут. После выброса супернатанта добавьте 500 микролитров PBS и хорошо вихрь. Выбросьте супернатант после центрифугирования и повторите шаг.
Затем смешайте один миллиграмм анти-KCC2 треонина 906 и анти-KCC2 треонина 1007 антител с 200 микролитрами бусин белка G Sepharose, прежде чем восполнить объем до 500 микролитров с PBS. После встряхивания на вибрирующей платформе или вращающемся колесе в течение двух часов при четырех градусах Цельсия повторите две промывки с PBS. Проводят количественную оценку белка на клеточных лизатах и добавляют один миллиграмм клеточного лизата в промытые шарики и инкубируют в сквозном ротаторе перед вращением вниз.
Дайте три промывки с PBS, содержащим 150 миллимоляров хлорида натрия, затем три промывки с 200 микролитрами PBS перед повторным использованием конечной гранулы в 100 микролитрах буфера образца LDS. Встряхните трубки в роторном шейкере при комнатной температуре в течение пяти минут. Инкубируйте их в нагревательном блоке и центрифугируйте их перед использованием супернатанта для загрузки геля.
Соберите литейный аппарат Western Blot и залейте свежеприготовленный 8%-ный разделительный гель для отливки геля, оставляя около двух сантиметров пространства от верхней части литейного стекла. Добавьте в установку 200 микролитров абсолютного изопропанола и дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 60 минут. Удалите изопропанол с помощью пипетки и тщательно промойте гель примерно 200 микролитрами дистиллированной воды.
После добавления свежеприготовленного 6% укладочного геля в кастинг-установку аккуратно влейте в заготовку и дайте постоять при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем закрепите отлитый гель в резервуаре для электрофореза. После наливания бегущего буфера в резервуар загрузите пять микролитров маркера молекулярной массы в первую лунку и равное количество белка в каждую лунку геля SDS-PAGE.
Заполните пустые колодцы СПД и запускайте гель в течение примерно 90-120 минут при 120 вольтах. Регидратировать нитроцеллюлозную мембрану с буфером переноса, содержащим 20% метанола. Промойте гель и мембрану с помощью переносного буфера и аккуратно распределите их по подготовительному стеку.
Расположите бутерброд для переноса в таком порядке: отрицательный электрод, сэндвич-пена, промытый фильтровальной бумагой гель SDS-PAGE, промытая нитроцеллюлозная мембрана, фильтровальная бумага, сэндвич-пена, положительный электрод. После этого сложите собранный сэндвич в резервуар для переноски и работайте при 90 вольтах в течение 90 минут или 30 вольт в течение 360 минут. Блокируйте сухую мембрану в течение одного часа при комнатной температуре с помощью блокирующего буфера.
Инкубируют мембраны с соответствующими разведениями первичных антител и бета-актина в блокирующем буфере в течение одного часа при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах Цельсия. Затем дайте три промывки TBST в течение пяти минут каждая. Инкубировать промытую мембрану вторичным антителом, разведенным в блокирующем буфере в течение 60 минут и повторить три промывки TBST.
После этого поместите промытую мембрану на плату для визуализации. Для выработки сигналов распределите раствор, приготовленный путем смешивания равных объемов каждого усиленного хемилюминесцентного реагента на мембране перед переносом платы визуализации в систему визуализации для визуализации. Лечение клеток HEK293 ставроспорином и N-этилмалеймидом или NEM вызывало снижение фосфорилирования на целевых участках SPAK, треонин 233, расположенный в домене киназы Т-петли, и сайт фосфорилирования S-петли серин 373 эндогенно экспрессированного SPAK.
Ставроспорин уменьшал фосфорилирование серина 940 в клетках HEK294, стабильно экспрессирующих KCC2b, но NEM значительно увеличивал его фосфорилирование. Кроме того, ставроспорин уменьшает фосфорилирование на участке треонина 505, тогда как NEM вызывает незначительное, но незначительное увеличение фосфорилирования на том же участке. Дифференциальное влияние обоих соединений на фосфорилирование протеинкиназы С на участке треонина 505 и KCC2b на участке серина 940 хорошо коррелируют.
Репрезентативный результат также показал, что NEM вызвал значительное увеличение экспрессии общего количества KCC2, тогда как экспрессия общего количества NKCC1 и SPAK не была существенно изменена при лечении обоими соединениями. Кроме того, эти два соединения вызывали снижение фосфорилирования SPAK на участках треонина 233 и серина 373, и это коррелировало с сокращенным фосфорилированием треонина 906/1007 и треонина 203/207/212 и эндогенно экспрессированного NKCC1 соответственно. Кроме того, ставроспорин и NEM уменьшали и увеличивали фосфорилирование протеинкиназы C на участке серина 940 и стабильно экспрессируемого KCC2b соответственно, что коррелировало с уменьшением и увеличением фосфорилирования дельты протеинкиназы C на участке треонина 505 при лечении ставроспорином и NEM соответственно.
Если используется неправильное первичное или вторичное антитело, полоса не будет видна во время визуализации. Также сигнал может быть не виден, если используется слишком низкая концентрация антител. Методика является актуальным инструментом количественного анализа белка и позволила использовать ее для многих научных и ресурсных целей, в том числе в качестве эффективного инструмента ранней диагностики.
