该协议可以通过直接评估其激酶分子大小磷酸化来帮助了解KCC2调节所涉及的机制，从而阐明其生理功能和活性。它可用于从相关分子的复杂混合物中鉴定和表征感兴趣的蛋白质等分子，即使蛋白质表达非常微小。该技术是复杂系统蛋白质分析以及识别异常组织功能或疾病的潜在机制的重要工具。
演示这些程序的将是我实验室的博士生所罗门·乔西亚（Sunday Solomon Josiah）。首先在37摄氏度的珠浴中预布防所有试剂，并在珠浴中完全解冻稳定横断面的大鼠KCC2b人胚胎肾293细胞。然后将细胞从冷冻小瓶管转移到含有5毫升新鲜培养基的离心管中，并以1， 200 G离心细胞三至五分钟。
使用固定在真空泵上的吸液器移液器吸出上清液后，将细胞重悬于10毫升新鲜培养基中。将悬浮液转移到10厘米的培养皿板上，使其在温度为37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中生长48小时。一旦细胞达到90%汇合度，通过吸出旧培养基并用两毫升PBS冲洗来分裂它们。
加入两毫升胰蛋白酶，在室温下孵育约一到两分钟。使用两毫升完整培养基洗涤胰蛋白酶消化的细胞。在新菜肴中加入 9 毫升新鲜培养基。
然后将旧盘中的一毫升溶液加入新盘中。将分裂细胞培养皿转移到培养箱中48小时，以达到90%以上的汇合度。在裂解缓冲液中收获之前，用二甲基亚砜、8 微摩尔星形孢菌素或 0.5 毫摩尔 N-乙基马来酰亚胺处理细胞 15 分钟。
从横断面培养皿中吸出培养基，将培养皿放在冰上，并用冰冷的PBS清洗细胞。吸出PBS，并在培养皿中加入1.0毫升冰冷的裂解缓冲液。使用冷塑料细胞刮刀从培养皿底部刮下细胞后，将细胞悬液转移到放在冰上的微量离心管中，然后在4摄氏度下持续搅拌30分钟。
在冷离心机中离心细胞裂解物后，将其放在冰上。将上清液收集到预冷的新鲜管中，并丢弃沉淀。将300微升蛋白G琼脂糖移液到微量离心管中。
然后将溶液以500 G离心两分钟。弃去上清液后，加入500微升PBS并涡旋良好。离心后弃去上清液并重复该步骤。
接下来，将一毫克抗 KCC2 苏氨酸 906 和抗 KCC2 苏氨酸 1007 抗体与 200 微升蛋白 G 琼脂糖珠混合，然后用 PBS 将体积补足至 500 微升。在振动平台或旋转轮上以四摄氏度摇晃两小时后，用PBS重复两次洗涤。对细胞裂解物进行蛋白质定量，并将一毫克细胞裂解物添加到洗涤的珠子中，并在旋转之前在端到端旋转器中孵育。
用含有150毫摩尔氯化钠的PBS洗涤三次，然后用200微升PBS洗涤三次，然后将最终沉淀重悬于100微升LDS样品缓冲液中。在室温下在转子振动器中摇动试管五分钟。将它们在加热块中孵育并离心，然后使用上清液进行凝胶上样。
组装蛋白质印迹铸造设备并倒入新鲜制备的8%分离凝胶以浇铸凝胶，从铸造玻璃顶部留出约两厘米的空间。向设置中加入 200 微升绝对异丙醇，使其在室温下静置 60 分钟。使用移液管除去异丙醇，并用约200微升蒸馏水仔细冲洗凝胶。
将新鲜制备的6%堆积凝胶加入铸件设置后，轻轻放入孔梳中，并在室温下静置30分钟。然后将灌制凝胶固定到电泳槽中。将电泳缓冲液倒入电泳槽后，将5微升分子量标记物加载到第一个孔中，并将等量的蛋白质加载到SDS-PAGE凝胶的每个孔中。
用LDS填充空孔，并在120伏下运行凝胶约90至120分钟。用含有20%甲醇的转印缓冲液重新水化硝酸纤维素膜。用转印缓冲液冲洗凝胶和膜，并将它们轻轻地铺在制备堆栈上。
按以下顺序排列要转移的三明治:负极，三明治泡沫，滤纸冲洗SDS-PAGE凝胶，漂洗的硝酸纤维素膜，滤纸，夹心泡沫，正极。完成后，将组装好的三明治堆叠在传输罐中，并以 90 伏运行 90 分钟或以 30 伏运行 360 分钟。使用封闭缓冲液在室温下封闭干燥膜一小时。
将膜与适当稀释的一抗和β-肌动蛋白在封闭缓冲液中孵育一小时，或在4摄氏度下孵育过夜。然后洗三次TBST，每次五分钟。将洗涤后的膜与在封闭缓冲液中稀释的二抗孵育60分钟，并重复TBST的三次洗涤。
完成后，将洗涤后的膜放在成像板上。为了显影信号，在将成像板转移到成像系统进行成像之前，将通过在膜上混合等体积的每种增强化学发光试剂制备的溶液展开。用星形孢素和N-乙基马来酰亚胺或NEM处理HEK293细胞导致SPAK靶位点磷酸化减少，苏氨酸233位于T环激酶结构域，S环磷酸化位点丝氨酸373内源性表达的SPAK。
Staurosporine降低了稳定表达KCC2b的HEK294细胞中丝氨酸940的磷酸化，但NEM显着增加了其磷酸化。此外，星形孢菌素降低苏氨酸505位点的磷酸化，而NEM在同一位点引起磷酸化的轻微但微不足道的增加。两种化合物对苏氨酸505位点的蛋白激酶C和丝氨酸940位点的KCC2b磷酸化的差异影响密切相关。
代表性结果还表明，NEM引起总KCC2量的表达显著增加，而两种化合物处理时总NKCC1和SPAK的表达没有显著变化。此外，这两种化合物在苏氨酸233和丝氨酸373位点引起SPAK磷酸化降低，这与苏氨酸906/1007和苏氨酸203/207/212的节磷酸化以及内源性表达NKCC1相关。此外，星形孢素和NEM分别降低和增加丝氨酸940位点蛋白激酶C的磷酸化和稳定表达KCC2b，分别与星形孢素和NEM处理后苏氨酸505位点蛋白激酶C δ磷酸化的减少和增加相关。
如果使用了不正确的一抗或二抗，则在成像过程中看不到条带。此外，如果使用浓度过低的抗体，信号可能不可见。该技术是蛋白质定量分析的相关工具，并允许将其用于许多科学和资源目的，包括作为有效的早期诊断工具。
