Этот метод позволит характеризовать различные иммунные клетки в одинаковых состояниях заболевания людей с ИМ, что расширит наше понимание механизма ВЭБ-инфекции. Продемонстрировать процедуру будет Линьлинь Чжан, врач из нашей лаборатории. Для начала возьмите PBMCs, выделенные ранее в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке, и вращайте ее при 300 G в течение 10 минут при комнатной температуре.
Выбросьте супернатант и повторно приостановите клетки с 80 микролитрами подготовленного буфера. Затем добавьте 20 микролитров микрогранул CD 14 микрошариков в клеточную суспензию, хорошо перемешав путем пипетки, и инкубируйте трубку в течение 15 минут на льду. Затем промывайте НБМК с помощью одного миллилитра буфера и центрифуги при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Отбросьте весь супернатант и повторно подвешивайте клетки с 500 микролитрами буфера. Для магнитной сепарации поместите колонну на магнитный сепаратор шариков и загрунтуйте колонну, промыв ее тремя миллилитрами буфера. Затем добавьте приостановку ячейки в столбец.
Дайте ему пройти и соберите немаркированные клетки в 15-миллилитровую центрифужную трубку. Промыть колонну три раза тремя миллилитрами буфера и собрать все сточные воды в 15-миллилитровую центрифужную трубку. Теперь поместите колонну в новую 15-миллилитровую центрифужную трубку и добавьте пять миллилитров буфера в колонну.
Плотно вставьте плунжер в колонну, чтобы смыть магнитно меченые ячейки в трубку. Центрифугируйте магнитно меченые ячейки при 300 G в течение пяти минут. После удаления супернатанта повторно приостановите клетки в 500 микролитрах PBS и перенесите клеточную суспензию в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку для последующего секвенирования транскриптома.
Гранулируют собранные немаркированные клетки центрифугированием при 300 Г в течение пяти минут и повторно суспендируют клетки в 100 микролитрах PBS в 1,5-миллилитрной микроцентрифужной трубке. Затем добавьте два микролитра каждого меченого антитела в клеточную суспензию и инкубируйте на льду в течение 30 минут, защищенных от света. Далее аликвота 100 микролитров клеточной суспензии PBMC в 1,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирках для создания отрицательного контрольного образца CD 3, CD 4, CD 8 и CD 19, образцов с одним окрашиванием и образца окрашивания CD 56 или CD 16.
Затем добавьте в каждую трубку два микролитра соответствующего флуоресцентно меченого антитела и высиживайте на льду в течение 30 минут, защищенных от света. После инкубации промыть все клетки PBS, как показано ранее, и повторно суспендировать в 500 микролитрах PBS. Откройте систему сортировки ячеек и запустите программу включения питания.
Затем установите 85-микрометровое сопло и откройте сортировочный поток. Установите напряжение сортировки на 4 500 вольт, а частоту на 47. Установите зазор на 8 в окне прерывания и включите режим автоматической сортировки «сладкого пятна», чтобы автоматически определить значение амплитуды капель.
Наконец, отрегулируйте задержку капель до 30,31 в окне бокового потока. Используя прямой и боковой точечный график рассеяния, нарисуйте полигональный затвор P1, чтобы идентифицировать интактную популяцию лимфоцитов. Затем, используя прямую область рассеяния против точечной диаграммы высоты, нарисуйте полигональный затвор P2 для идентификации одиночных ячеек и исключите дублеты.
Затем, используя область CD 19 FITC по сравнению с CD 3 на точечный график области CPCY 5.5, нарисуйте прямоугольный затвор P3 для выбора CD 3 положительных Т-клеток и CD 19 положительных В-клеток. Затем, используя точечный график области CD 4 APCCY 7 против точечной диаграммы области CD 8 PE, нарисуйте прямоугольный затвор для выбора CD 4 и CD 8 положительных Т-клеток. Наконец, используя область бокового рассеяния по сравнению с CD 56 или CD 16 APC точечный график, нарисуйте прямоугольный затвор для выбора CD 56 или CD 16 положительных естественных клеток-киллеров.
Для отрицательной контрольной трубки щелкните нагрузку на панели сбора и выберите настройки цитометра в программном обеспечении. В окне инспектора перейдите на вкладку параметров и отрегулируйте напряжение прямого рассеяния, бокового рассеяния и различных флуоресцентных красителей. После загрузки одиночных окрашенных трубок в цитометр нажмите кнопку «Загрузка» на панели сбора, затем перейдите на вкладку компенсации, чтобы настроить компенсацию, как описано в тексте.
Осторожно вращайте клеточную суспензию, прежде чем загрузить трубку в цитометр. Добавьте 200 микролитров FBS к четырем трубкам сбора и вихрь трубок. Поместите их в камеру сбора цитометра.
Соберите различные типы клеток отдельно в четыре проточные трубки. Раскрутите разделенные клетки при 300 G в течение пяти минут и добавьте 200 микролитров реагента изоляции РНК в клеточную палитру для секвенирования транскриптома. В настоящем исследовании субпопуляции иммунных клеток из периферической крови различных образцов были эффективно отсортированы путем объединения методов иммуномагнитных шариков и флуоресцентной активации сортировки клеток.
Важно отметить, что в этом протоколе этап сортировки клеток был оптимизирован для повышения жизнеспособности клеток. Отсортированные иммунные клетки показали повышенную долю CD 3, CD 8 положительных Т-клеток у пациентов с инфекционным мононуклеозом по сравнению как со здоровыми носителями вируса Эпштейна-Барра, так и с неинфицированными образцами. Напротив, снижение пропорций CD 3, CD 4 положительных Т-клеток и CD 19 положительных В-клеток наблюдалось у пациентов с инфекционным мононуклеозом по сравнению со здоровыми носителями ВЭБ и неинфицированными детьми.
Кроме того, снижение пропорций CD 56 или CD 16 положительных естественных клеток-киллеров наблюдалось у пациентов с инфекционным мононуклеозом по сравнению с неинфицированными детьми с ВЭБ. Поддержание жизнеспособности клеток жизненно важно для последующего эксперимента. Хранение клеток на льду или в холодильнике во время процесса сортировки полезно для жизнеспособности клеток.
