Общая цель этой методологии состоит в том, чтобы выйти за пределы оптического предела большинства цитометров потока, позволяя исследователю записывать пять дополнительных маркеров для опроса сложных популяций клеток. Используя этот метод, можно достичь глубокого иммунофенотипинга при работе с прибором с низким количеством детекторов или образца с ограниченным количеством клеток. Начните эту процедуру с тщательной передачи втянутой крови в 50-миллилитровую коническую трубку.
Разбавить кровь равным количеством PBS без кальция и магния. Добавьте 15 миллилитров градиентной среды плотности на дно новой 50-миллилитровой конической трубки. Тщательно наложить разбавленную кровь на верхней части плотности градиента среды, избегая любого смешивания между плотностью градиента среды и разбавленной крови.
Центрифуга при 400 раз г в течение 30 минут при комнатной температуре без тормоза, чтобы избежать нарушения интерфейса. После центрифугации используйте пипетку, чтобы тщательно аспирировать и отбросить верхний слой, обращая внимание на то, чтобы не удалять клетки на стыке плазмы и градиентной среды плотности. Соберите как можно больше периферических моноядерных клеток крови, или PBMCs, как это возможно из интерфейса, не касаясь гранул красных клеток в нижней части 50-миллилитровой конической трубки, и перейти к новой трубке.
Добавить PBS довести окончательный объем до 25 миллилитров, и инвертировать несколько раз, чтобы смешать. Затем вымойте ПМГ в два раза, как указано в тексте. После удаления тромбоцитов и подсчета ПБМТ, как описано в тексте, повторное распределение клеток в PBS, 0,1% азида натрия до концентрации от 1 раза от 10 до седьмого клетки на миллилитр.
Для подготовки ПХМГ к окрашиваниям перенесите 100 микролитров каждого образца на пластину v-bottom на 96 хорошо. Центрифуга пластины при 350 раз г в течение трех минут при комнатной температуре. Тщательно аспирировать супернатант, не нарушая гранулы клетки.
К каждому хорошо, добавить 100 микролитров PBS, содержащих живые / мертвые фиксации красителя, который реагирует со свободным амином на белки, и повторно использовать смесь PBMC тщательно. Впоследствии, позвольте пластине сидеть в течение 10 минут при комнатной температуре для маркировки мертвых клеток. Для каждого образца приготовьте 30 микролитров смеси, содержащей все семь антител.
На этом этапе, титровали антитела против различных молекул-мишеней и в различных фторхромов могут быть добавлены также. Центрифуга 96-хорошо пластины в 350 раз г в течение трех минут при комнатной температуре, и тщательно аспирировать супернатант, не нарушая гранулы клетки. Добавить антитела коктейль к каждому хорошо, и повторно тщательно, не генерируя пузырьки.
Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Через 30 минут добавьте по 150 микролитров буфера окрашивания к каждой колодец и центрифугайте пластину при 350 г в течение трех минут при комнатной температуре. Тщательно аспирировать супернатант, не нарушая гранулы клетки, и повторного перерасхода клеток в 200 микролитров PBS.
Клетки теперь готовы к анализу цитометрии потока. Анти-CD3, CD8, CD14, CD19 и TCR гамма-дельта антитела titrated с максимальной кривой индекса окрашивания. Титрование антител является наиболее важным шагом в этом протоколе, чтобы правильно определить семь подмножество иммунных клеток с помощью двух фторхромов.
Чтобы подготовить двухкратное разбавление антител, заполните 10 скважин пластины 96 скважин с 40 микролитров окрашивания буфера на скважину. Для целей этого видео, только название анти-CD8 будет показано. В первой хорошо, увеличить конечный объем до 80 микролитров окрашивания буфера, и добавить анти-CD8 в концентрации в четыре раза концентрации, предложенной производителем.
Хорошо перемешайте и перенесите 40 микролитров на вторую колодец. Хорошо перемешать и повторить этот шаг для всех других скважин. Пятно 10 образцов ПБМТ или цельной крови с 30 микролитров из 10 различных двукратных разбавления анти-CD8 после протокола, продемонстрированого ранее.
Приобретайте данные с помощью цитометра потока и навеяйте сигнал от каждого разбавления. После расчета индекса пятен для каждой концентрации антител, как описано в тексте, участок пятно индекс по сравнению с концентрацией антитела выражается как доля разбавления антитела, и определить концентрацию антитела с максимальным значением индекса пятна. Чтобы титровать анти-CD4 и анти-CD56 антитела, начните с двухкратной стратегии разбавления продемонстрировали ранее, добавив дополнительные концентрации между ними, чтобы тонко определить диапазон концентрации, что позволит отделение CD4-положительных Т-клеток и НК-клеток от других популяций клеток.
Титрат анти-CD4 антитела, поставив анти-CD4 сигнал между двойной CD8-положительный, CD3-положительный сигнал и CD3 одной положительной популяции. Титрат анти-CD56 антитела следующие стратегии, аналогичные анти-CD4 антитела titration, путем размещения НК-клеток между CD3-отрицательных и CD3-положительных популяций. Чтобы начать эту двухфлорохромную стратегию 7-маркерного гатинга, выберите ворота лимфоцитов и создайте точечный участок с одним из двух фторхромов, используемых в этом протоколе на каждой оси.
Ворота на CD8-положительных Т-клеток, идентифицированных как CD3 и CD8 двойные положительные клетки в правом верхнем углу участка точки. Исключите тусклаю популяцию CD8, которая может содержать клетки NKT. Ворота на CD4-положительных Т-клеток определены как население между CD8-положительных Т-клеток и CD3 одной положительной популяции.
Ворота на гамма-дельта Т-клеток определены как высокие клетки CD3. Субдивид гамма-дельта Т-клеток на CD8 положительные и CD8 отрицательные. Ворота на НК-ячейках, идентифицированных как популяция между CD3-положительными и CD3-отрицательными ячейками.
Подраздеть клетки НК на CD8 положительные и CD8 отрицательные. Ворота на B-ячейках, идентифицированных как CD3-отрицательная, CD19-положительная популяция в правом нижнем углу точечного участка. Выберите ворота моноцитов и создайте точечный участок с одним из двух фторхромов, используемых в этом протоколе на каждой оси.
Ворота на CD3-негативное, CD14-позитивное население. Используя эту стратегию, лимфоциты у пациента с множественной миеломой были закрыты на основе их вперед рассеяния и бокового рассеяния и их цитометрического профиля потока. CD8-положительные субпопуляции памяти и наивные Т-клетки были определены по выражению CD45RA и CCR7.
Выражение HLA-DR и CD57 было использовано для изучения активации Т-клеток в CD8-положительной наивности, памяти, центральной памяти, памяти эффектора и эффекторной памяти CD45RA-положительных клеток. Аналогичным образом были выявлены CD4-положительные наивные и Т-клетки памяти. В популяции памяти, CCR4 и CCR6 были использованы для выявления T помощник субпопуляции в CD4-положительных Т-клеток.
Субпопуляции НК-клеток характеризовались выражением CD16 и CD57. Эта стратегия была использована для исследования динамики в иммунных популяциях продольных образцов от донора с множественной миеломой, получающим трансплантацию стволовых клеток. Характеристика субпопуляций CD8 и CD4 с течением времени показала устойчивую CD4-положительную и CD8-положительную активацию Т-клеток и перекос T-помощника в фенотип T-helper-one.
Но в день 60, процент В-клеток резко увеличилось, предсказывая рецидив пациента. Правильная подготовка клеток и титрование антител являются критическими шагами для достижения надежных результатов с помощью этого метода. Антитела, нацеленные на другие маркеры, могут быть добавлены для выполнения более глубокого анализа цитометрии потока и создания модульных цитометрических панелей потока, нацеленных на несколько линий одновременно.
Аналогичные подходы, направленные на расширение числа рекордных маркеров, могут быть также разработаны с использованием различных наборов маркеров или для использования в различных моделях животных. Не забывайте, что азид натрия может вызвать ожоги кожи и глаз. Поэтому при обращении с этим реагентом всегда следует носить лабораторное пальто, защитные очки и перчатки.
