Мы представляем протокол для подготовки свободно плавающих культур ломтик из ткани мозга, собранные из живых человеческих доноров, представленных на ресективную операцию на головном мозге. Эта культура является подменой для выполнения биохимических и клеточной биологии анализы или иммуногистохимии. Ожидается, что это будет способствовать выяснению механизма, лежащего в основе нейродегенерации при сопутствующих заболеваниях мозга.
Основным преимуществом этой техники является то, что это более простая и экономически эффективная альтернатива классическому протоколу культуры срезов с использованием мембранных вставок. Хотя общий протокол не является сложным, некоторые шаги, такие как удаление ополчеек, приклеивание ткани к диску образца вибромы, и ресекция для иммуногистохимии лучше всего понять, когда продемонстрировали визуально. Помочь продемонстрировать процедуру будут Ниле Мендес и Глаусия Альмедиа, которые являются аспирантами, и Джованна Ногейра, еще один аспирант.
Чтобы начать эту процедуру, добавьте соль в ведро со льдом. Перенесите нарезающий раствор в это ведро и дайте ему отдохнуть под карбогенной смесью, восходящей в течение по крайней мере 20 минут до использования. Затем приготовьте блок 3%agarose, который составляет около двух сантиметров на два сантиметра на два сантиметра.
Супер клей агарозы блок вибромы образца диска для того, чтобы создать дополнительную механическую поддержку образца ткани во время нарезки. На виброме установите толщину сечения до 200 микрометров, частоту вибрации до 100 герц, и выберите скорость нарезки от 0,5 до 1,0 миллиметра в секунду. Затем заблокировать виброметр буфер лоток к базе вибромы и добавить лед, чтобы держать его в холодильнике до получения нарезки раствора и образца и на протяжении всей процедуры нарезки.
Во-первых, создать транспортный аппарат, который состоит из портативного газового баллона, содержащего карбогенную смесь, соединенную с клапаном потока давления, который контролирует выход газа, подключенный к силиконовым трубам, который соединяет эту газовую продукцию с транспортным судном и транспортным судном, которое содержит транспортный раствор и лед для пробного охлаждения во время транспортировки. Сбор и транспортировка образца и транспортировки, как указано в текстовом протоколе. Перенесите образец в чашку Петри, содержащую нарезающий раствор.
Используя тонкие хирургические инструменты, тщательно удалите как можно больше оставшихся око меньшего. Выберите лучшую ориентацию образца для производства ломтиков с особыми характеристиками экспериментального дизайна и используйте лезвие скальпеля номер 24, чтобы обрезать плоскую поверхность, чтобы быть основанием, которое будет приклеено к диску образца. Используя пластиковую ложку и тонкие кисти, соберите фрагмент из чашки Петри и высушите лишний раствор фильтровальной бумагой.
Далее используйте супер клей, чтобы прикрепить ткань к виброме образца блюдо, пока он твердо придерживается блюдо и в контакте с блоком агарозы. Поместите диск образца вибромы в буферный лоток виброма. Заблокив держатель ножа на месте с лезвием бритвы прочно закреплены.
Добавьте нарезающее решение и убедитесь, что оно покрывает как образец, так и лезвие. Затем начните нарезать образец на 200 микрометров ломтиками. Перенесите ломтики из буферного лотка в чашку Петри, содержащую нарезной раствор, и обрежьте любые свободные края и избыток белого вещества до доли примерно 70% коры и 30%белого вещества.
В шкафу ламинарного потока добавьте 600 микролитров культуры среды к каждому колодец 24-хорошо пластины и инкубировать при 36 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа, по крайней мере 20 минут до покрытия ломтиками. После этого используйте кисть, чтобы пластины один ломтик в каждом хорошо. Если в тарелке есть неиспользованные колодцы, заполните их 400 микролитров стерильной воды.
Инкубировать при 36 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом. Дополнение 10 миллилитров ранее подготовленной среды культуры с мозгом, полученным нейротрофическим фактором при концентрации 50 нанограмм на миллилитр. Через 8-16 часов удалите из каждой колодец 333 микролитров кондиционированной среды и добавьте 133 микролитров свежей BDNF дополненной среды.
Заменить одну треть кондиционированной среды со свежим BDNF дополняется среды каждые 24 часа. Во-первых, перенесите ломтики из колодцев, содержащих культурную среду, на новую пластину из 24 скважин, содержащую PBS. Удалите PBS из каждой хорошо и заменить его на один миллилитр 4%paraformaldehyde.
Инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующий день осторожно удалите параформальдегид из скважин и замените его одним миллилитром 30%-ного раствора сахарозы. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 48 часов.
Через 48 часов установите замораживание микротома до минус 40 градусов по Цельсию. Подготовьте основание сахарозы на стадии микротома, где ломтики должны быть помещены. После того, как он полностью заморожен, вырезать некоторые из замороженных сахарозы производить плоскую поверхность, на которой ломтик будет помещен.
Затем поместите каждый кусочек на растянутую пластиковую пленку и используйте кисть, чтобы сгладить ткани. За один ход перенесите растянутый кусочек на основание замороженной сахарозы. После того, как ломтик отдохнул в течение пяти-десяти минут, чтобы заморозить правильно, разрезать ломтик на 30 микрометровых секций.
Перенесите 30-метровые секции в чашку Петри, содержащую PBS, и приступайте к гистологическому протоколу, адекватному экспериментальному проекту. При определении качества и здоровья культурных ломтиков, важнейшим аспектом для оценки является наличие и типичная морфология ожидаемых типов нервных клеток, нейронов и глиальных клеток. Типичная архитектура человеческого коркового ламинирования наблюдается в ломтике в день в пробирке четыре выявлены нейронального иммунолабеля.
Кроме того, наблюдается ожидаемое присутствие микроглии и астроглии. Эти результаты показывают, что архитектура тканей не сильно зависит ни от хирургической процедуры, обработки образцов, ни от краткосрочного периода in vitro. Нейрональная реакция на деполяризацию хлорида калия также была количественно оценена в культурных ломтиках, следуя фосфорилированию ERK.
Интересно, что явное увеличение фосфорилирования ERK наблюдается в хлорид калия обработанных ломтиков в день в пробирке четыре. Наконец, реакция ломтиков в день в пробирке четыре токсичных вызов оценивается с известным окислительным стрессом индуктор перекиси водорода. Разоблачение ломтиков до 300 миллимолейных перекиси водорода в течение 24 часов привело к сильному снижению МТТ.
Взятые вместе, массовая гибель клеток наблюдается в день в пробирке пять ломтиков после перекиси водорода вызов и хлорид калия индуцированных результатов деполяризации указывают на сохраненное общее состояние здоровья ломтиков в день в пробирке четыре, которые реагируют на токсичные стимулы, такие как окислительный стресс. Этот протокол в основном посвящен исследованиям, основанным на анализах продолжительностью более одной недели, таких как исследование молекулярных механизмов нейротоксичности и нейропротектории препаратами-кандидатами. Хотя этот протокол посвящен использованию корковых тканей, собранных у пациентов, представленных на хирургическое лечение для микрорезистентной эпилепсии височной доли, вполне вероятно, что ткани, собранные из других областей мозга или условий также могут быть источниками для производства свободно плавающих культур ломтик.
Нарезка культур из взрослого человеческого мозга может быть ключевым в продвижении нашего понимания невропатологии человека из-за их уникальной клеточной схемы и молекулярной техники не хватает ломтиков, производимых из мозга грызунов.
