Этот метод позволит нам выделить вирусные частицы Эпштейна Барра из клеточной линии P3HR1 и количественно оценить запас вируса, чтобы его можно было использовать для различных исследовательских целей. Основным преимуществом этой методики является то, что она обеспечивает относительно простой, недорогой, быстрый и надежный метод приготовления вирусного запаса ЭБ. Жизненно важные частицы, полученные с помощью этого метода, могут быть использованы во многих экспериментальных моделях in vitro или in vivo для диагностики EB.To начать, подготовить объем клеточной суспензии А в 15-миллилитровой конической трубке, отрегулировать объем таким образом, чтобы количество клеток составляло примерно 2,2 миллиона клеток для 100-миллиметровой культуральной пластины.
Добавьте в пробирку пять миллилитров полной питательной среды. Добавьте в пробирку 80 микролитров диметилсульфоксида. Затем добавьте в трубку 350 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр ПМА.
Конечная концентрация PMA должна составлять 35 нанограмм на миллилитр, а концентрация DMSO должна составлять 0,08%. Добавьте 4,27 миллилитра питательной среды, чтобы общий объем составлял 10 миллилитров. Перемешайте содержимое трубки путем наклона, затем перенесите содержимое на 100-миллиметровую культуральную пластину. Оставьте пластину в инкубаторе клеточной культуры на пять дней при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа.
Через пять дней в инкубаторе центрифугируют содержимое пластинки на 120 г в течение восьми минут, чтобы гранулировать клетки Соберите бесклеточный вирус, содержащий супернатант, и выбросьте клеточную гранулу. Снова центрифугируют супернатант при 16 000 Г в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать вирусные частицы. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу вируса в пяти миллилитрах питательной среды, аликвотируйте вирусную суспензию в 20 пробирок, каждая из которых содержит 250 микролитров вирусной суспензии, и храните суспензию при минус 80 градусах Цельсия.
Для отделения белков от ДНК добавляют 500 микролитров насыщенного трисом фенола в одну из пробирок, содержащих вирусный препарат. Добавьте 100 микролитров воды и хорошо вихревое, чтобы получить розовую эмульсию. Центрифуга в течение 15 минут при 9, 650 G, соберите супернатант и перенесите его в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.
Добавьте эквивалент одной десятой объема супернатанта холодного ацетата натрия и перемешайте путем пипетирования вверх и вниз. Затем добавляют один микролитр 20 миллиграммов на миллилитр гликогена и перемешивают путем пипетирования. Добавьте в три раза больше объема супернатанта холодного 100%-го этанола и храните его при минус 80 градусах Цельсия в течение ночи.
Выделяют центрифугу вирусной ДНК при 9, 650 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте супернатант для получения гранулы ДНК и промыть гранулу три раза одним миллилитом холодного 70%-го этанола. Снова центрифугируют при 9, 650 G в течение 15 минут и выбрасывают супернатант.
После воздушной сушки гранулы в течение примерно 10 минут повторно суспендируйте гранулу в 10-50 микролитрах дистиллированной воды без нуклеазы. Храните образцы при минус 20 градусах Цельсия для последующей обработки или при четырех градусах Цельсия в течение ночи, чтобы обеспечить максимальное растворение ДНК, с последующим хранением при минус 20 градусах Цельсия. После очистки постамента микроспектрофотометра с деликатной задачей стеклоочистителя загружают один микролитр подготовленного образца ДНК и отмечают концентрацию ДНК в образце.
Проверьте соотношения поглощения как на 260-280 нанометрах, так и на 260-230 нанометрах. ДНК будет поглощать на 260 нанометрах, белки на 280 нанометрах, а органические вещества, такие как фенол, будут поглощать на 230 нанометрах. Соотношение 1,8 к 2 считается достаточным для ПЦР в реальном времени.
Чтобы приготовить реакционные смеси ПЦР, поместите пять микролитров кибер-зеленой ПЦР-смеси в реальном времени в 0,2-миллилитровые ПЦР-трубки. Добавьте один микролитр 7,5 кролей пико на микролитр передней грунтовки и один микролитр 7,5 кролей пико на микролитр обратной грунтовки в каждую трубку. Здесь амплифицируется малый ген РНК 2 ВЭБ.
Для определения числа копий генома ВЭБ. Затем добавьте два микролитра воды без нуклеазы и один микролитр вирусной ДНК в одну из пробирок. Общий объем реакционной смеси составляет 10 микролитров.
Подготовьте другие трубки, которые будут использоваться в качестве стандартов с известными номерами копий генома EBV. Запускайте ПЦР-смеси, начиная с начального этапа активации при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем 40 циклов при 95 градусах Цельсия в течение 15 секунд и при 58 градусах Цельсия в течение 30 секунд.
Экспортируйте все листы данных в виде CSV-файлов и рассчитайте журнал количества копий генома EBV на стандартную трубку и средних значений CQ. Сгенерируйте стандартную кривую qPCR, построив значения КТ стандартов на логарифм количества копий генома. Используя стандартное уравнение кривой, выведите количество копий генома ВЭБ в трубке ПЦР, содержащей индуцированную вирусную ДНК.
Наконец, используйте формулу, показанную на экране, чтобы рассчитать концентрацию индуцированного вирусного препарата. Здесь X — это количество копий генома ВЭБ, полученных из стандартной кривой, а F — фактор разбавления, используемый для настройки ДНК на реакцию ПЦР. Подсчет клеток с помощью камеры гемоцитометра показан здесь.
Четыре квадранта подсчитываются с помощью светового микроскопа. Здесь ячейки, обозначенные синим цветом, должны быть подсчитаны, в то время как клетки красным цветом не должны засчитываться, поскольку они касаются верхней, правой, нижней или левой границ квадранта. Было проведено оптимизационное испытание для определения концентраций PMA и диметилсульфоксида, которые дали бы наибольшее количество частиц EBV.
Концентрация ДМСО 0,8% и концентрация ПМА 35 нанограмм на микролитр были оптимальными и приводили к высоким концентрациям ВЭБ. Наша лаборатория использовала жизненно важные частицы, полученные с помощью этой техники, для изучения про-аутоиммунных или воспалительных реакций на этот вирус. А также разработать новые анти-ВЭБ агенты.
