Este método nos permitirá aislar las partículas del virus de Epstein Barr de la línea celular P3HR1 y cuantificar el stock de virus para que pueda usarse para diversos fines de investigación. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método relativamente fácil, económico, rápido y confiable para preparar un stock viral de EB. Las partículas vitales producidas por esta técnica se pueden utilizar en muchos modelos experimentales in vitro o in vivo para el diagnóstico de EB.To comenzar, preparar un volumen de suspensión celular A en un tubo cónico de 15 mililitros, ajustar el volumen de tal manera que el número de células sea de aproximadamente 2,2 millones de células para una placa de cultivo de 100 milímetros.
Agregue cinco mililitros de medio de cultivo completo al tubo. Agregue 80 microlitros de dimetilsulfóxido al tubo. Luego agregue 350 microlitros de un miligramo por mililitro PMA al tubo.
La concentración final de PMA debe ser de 35 nanogramos por mililitro, y la de DMSO debe ser de 0,08%Añadir 4,27 mililitros de medio de cultivo para que el volumen total sea de 10 mililitros. Mezcle el contenido del tubo inclinándolo y, a continuación, transfiera el contenido a una placa de cultivo de 100 milímetros. Deje la placa en una incubadora de cultivo celular durante cinco días a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono.
Después de cinco días en la incubadora, centrifugar el contenido de la placa a 120 G durante ocho minutos para granular las células Recoger el virus libre de células que contiene sobrenadante y desechar el pellet celular. Vuelva a centrifugar el sobrenadante a 16, 000 G durante 90 minutos a cuatro grados centígrados para granular las partículas del virus. Deseche el sobrenadante y resuspenda el gránulo de virus en cinco mililitros de medio de cultivo, Aliquote la suspensión viral en 20 tubos que contengan cada uno 250 microlitros de la suspensión viral y almacene la suspensión a menos 80 grados centígrados.
Para separar las proteínas del ADN, agregue 500 microlitros de fenol saturado de Tris a uno de los tubos que contienen la preparación viral. Añadir 100 microlitros de agua y vortex bien para obtener una emulsión rosa. Centrifugar durante 15 minutos a 9, 650 G, recoger el sobrenadante y transferirlo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Añadir un equivalente a una décima parte del volumen sobrenadante de acetato de sodio frío y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego agregue un microlitro de 20 miligramos por mililitro de glucógeno y mezcle con pipeteo. Agregue tres veces el volumen del sobrenadante de etanol frío al 100% y guárdelo a menos 80 grados centígrados durante la noche.
Para aislar el ADN viral centrífuga a 9, 650 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante para obtener un pellet de ADN y lave el pellet tres veces con un mililitro de etanol frío al 70%. Vuelva a centrifugar a 9, 650 G durante 15 minutos y deseche el sobrenadante.
Después de secar al aire el pellet durante unos 10 minutos, resuspender el pellet en 10 a 50 microlitros de agua destilada libre de nucleasa. Almacene las muestras a menos 20 grados centígrados para su posterior procesamiento o a cuatro grados centígrados durante la noche para garantizar la máxima disolución del ADN, seguida de un almacenamiento a menos 20 grados centígrados. Después de limpiar el pedestal de un micro espectrofotómetro con una tarea delicada, cargue un microlitro de la muestra de ADN preparada y observe la concentración del ADN en la muestra.
Verifique las proporciones de absorbancia tanto a 260 a 280 nanómetros como a 260 a 230 nanómetros. El ADN absorberá a 260 nanómetros, las proteínas a 280 nanómetros y las sustancias orgánicas como el fenol absorberán a 230 nanómetros. Una relación de 1,8 a 2 se considera suficiente para la PCR en tiempo real.
Para preparar las mezclas de reacción de PCR, coloque cinco microlitros de una mezcla de PCR en tiempo real verde cibernética en tubos de PCR de 0,2 mililitros. Agregue un microlitro de 7.5 pico moles por microlitro de imprimación directa y un microlitro de 7.5 pico moles por microlitro de imprimación inversa a cada tubo. Aquí, el gen EBV small RNA 2 se amplifica.
Determinar el número de copias del genoma del VEB. Luego agregue dos microlitros de agua libre de nucleasa y un microlitro de ADN viral a uno de los tubos. El volumen total de la mezcla de reacción es de 10 microlitros.
Prepare otros tubos que se utilizarán como estándares con números conocidos de copias del genoma del VEB. Ejecute las mezclas de PCR comenzando con un paso inicial de activación a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Luego 40 ciclos a 95 grados centígrados durante 15 segundos, y a 58 grados centígrados durante 30 segundos.
Exporte todas las hojas de datos como archivos CSV y calcule el registro del número de copias del genoma del VEB por tubo estándar y los valores medios de CQ. Generar una curva estándar de qPCR trazando los valores de TC de los estándares contra el logaritmo del número de copias del genoma. Empleando la ecuación de trazado de curva estándar, se deriva el número de copias del genoma del VEB en el tubo de PCR que contiene el ADN viral inducido.
Finalmente, use la fórmula que se muestra en la pantalla para calcular la concentración de la preparación viral inducida. Aquí X es el número de copias del genoma del VEB derivadas de la curva estándar, y F es el factor de dilución utilizado para configurar el ADN por reacción de PCR. Aquí se muestra el recuento de células utilizando una cámara de hemocitómetro.
Cuatro cuadrantes se cuentan con un microscopio óptico. Aquí se deben contar las celdas indicadas en azul, mientras que las celdas en rojo no deben contarse, ya que están tocando los bordes superior, derecho, inferior o izquierdo del cuadrante. Se realizó un ensayo de optimización para determinar las concentraciones de PMA y dimetilsulfóxido que producirían el mayor número de partículas de VEB.
Una concentración de DMSO de 0.8% y una concentración de PMA de 35 nanogramos por microlitro fueron óptimas y resultaron en altas concentraciones de EBV. Nuestro laboratorio utilizó las partículas vitales producidas por esta técnica para examinar las respuestas pro autoinmunes o inflamatorias a este virus. Así como para desarrollar nuevos agentes anti-EBV.
